新化合物甲胺鳶尾素抑制缺血心肌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 心肌缺血性損傷(Myocardial Ischemia,MI)是嚴(yán)重危害我國(guó)中老年人健康的重大疾病,也是最常見(jiàn)的猝死因?yàn)橹?。研究防治心肌缺血損傷的藥物具有重要的理論意義和社會(huì)意義。
　　 我們前期的研究結(jié)果表明,從葛花中提取分離的異黃酮化合物葛花苷具有明顯的耐缺氧活性和抗心肌缺血活性,亦具有明顯的改善血液粘度活性及抗血栓形成作用,但是該化合物水溶性較差,使其研究受到一定限制。因此,我們對(duì)葛花苷結(jié)構(gòu)進(jìn)行

2、修飾,在保留活性基團(tuán)的基礎(chǔ)上,增加水溶性基團(tuán),克服該化合物所存在的不足,得到一個(gè)新化合物-甲胺鳶尾素(methylamine irisolidone,MMI)。該化合物水溶性增加,易吸收。小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明,該新型化合物毒性較低。我們擬在此基礎(chǔ)上深入研究這一新化合物對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用,從其對(duì)缺血心肌細(xì)胞凋亡的影響深入研究其作用機(jī)制,為缺血性心臟病的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和創(chuàng)新型藥物。
　　 研究方法:
　

3、　 1.(1)分別采用過(guò)氧化氫(H2O2)、氯化鈷(CoCl2)和連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)制備不同的心肌細(xì)胞缺氧損傷模型,以MTT法檢測(cè)損傷心肌細(xì)胞細(xì)胞存活率,以確定誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型合適的藥物濃度及作用時(shí)間。(2)采用熒光染料Hoechst33342染色觀察缺氧損傷心肌細(xì)胞凋亡形態(tài),進(jìn)一步明確H2O2、CoCl2、Na2S2O4三種藥物誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型的最佳濃度。
　　 2.(1)甲胺鳶尾素預(yù)處理心肌細(xì)胞12h后

4、,采用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,以瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài),研究甲胺鳶尾素對(duì)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞形態(tài)的保護(hù)作用；以MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,確定甲胺鳶尾素對(duì)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。(2)以JC-1熒光染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化；同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察熒光分布,研究甲胺鳶尾素對(duì)氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
　　 3.(1)甲胺鳶尾素預(yù)處理心肌細(xì)胞12h后,采用Na2S2O4建立心肌細(xì)胞化學(xué)

5、性缺氧損傷模型,以MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,確定甲胺鳶尾素對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。(2)采用Hoechst33342染色觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài),研究甲胺鳶尾素對(duì)缺氧心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。(3)采用Annexin V-FITC/PI雙染,流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,進(jìn)一步確定甲胺鳶尾素抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。(4)采用超微量ATPase測(cè)定試劑盒測(cè)定心肌細(xì)胞總ATPase活性,確定甲胺鳶尾素對(duì)缺氧心肌細(xì)胞ATPase活性的改善作用。(5

6、)以JC-1熒光染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位變化,確定甲胺鳶尾素對(duì)缺氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位的保護(hù)作用以及與心肌細(xì)胞凋亡、ATPase之間的相關(guān)性。(6)以PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,研究甲胺鳶尾素對(duì)心肌細(xì)胞周期的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.H2O2、CoCl2、Na2S2O4不同濃度作用相應(yīng)時(shí)間均可顯著降低心肌細(xì)胞存活率,且隨濃度及作用時(shí)間增加心肌細(xì)胞存活率明顯降低,表明三者可對(duì)心肌細(xì)胞造成明顯損傷。Hoe

7、chst33342染色熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡狀態(tài),結(jié)果顯示,正常對(duì)照組細(xì)胞核完整,染色均勻,而模型組出現(xiàn)濃染強(qiáng)熒光細(xì)胞核,呈亮藍(lán)色的半月形、馬蹄形和小圓點(diǎn),邊界清晰、細(xì)胞核斷裂等典型的細(xì)胞凋亡特征。
　　 2.H2O2損傷模型組細(xì)胞存活率明顯低于正常組(P<0.01)；MMI0.1μmol/L預(yù)處理組與模型組相比細(xì)胞存活率無(wú)明顯差別(P>0.05)；從0.5μmol/L組開(kāi)始,與模型組比較,隨著MMI濃度升高細(xì)胞存活率明顯

8、升高(P<0.05,P<0.01),表明MMI預(yù)處理能增強(qiáng)心肌細(xì)胞抗氧化損傷能力,提高心肌細(xì)胞存活率。瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果顯示,與模型組比較,10μmol/L MMI能改善心肌細(xì)胞損傷。JC-1熒光染色結(jié)果顯示,模型組心肌細(xì)胞經(jīng)H2O2損傷后,與正常組比較,線粒體膜電位明顯降低,紅綠熒光比值減小(P<0.01)。1、5、10μmol/L MMI處理組與模型組相比,其紅綠熒光強(qiáng)度比值明顯升高(P<0.05),表明心肌細(xì)胞MMP下降減輕。<

9、br>　　 3.Na2S2O4損傷模型組細(xì)胞存活率明顯低于正常組(58.4±3.5％,P<0.01)；MMI(10、5、1μmol/L)組細(xì)胞存活率明顯高于模型組(88.8±3.2％,80.7±2.9％,67.1±4.3％vs58.4±3.5％,P<0.01),且隨著MMI濃度增加而升高。AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)果顯示,正常對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡較少,模型組心肌細(xì)胞凋亡率顯升高(P<0.01)；與模型組相比,MMI(10、5

10、、1μmol/L)預(yù)處理能明顯降低Na2S2O4誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率(P<0.01),MMI10μmol/L組對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用最強(qiáng)；同時(shí)Hoechst33342染色熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡形態(tài),結(jié)果顯示,正常對(duì)照組細(xì)胞核完整,而模型組出現(xiàn)細(xì)胞核斷裂、濃染等典型的細(xì)胞凋亡特征；與模型組相比,MMI(10、5、1μmol/L)預(yù)處理能明顯改善細(xì)胞凋亡狀態(tài),減少凋亡細(xì)胞數(shù)目。JC-1熒光染色結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組心肌細(xì)胞MMP明

11、顯降低,紅綠熒光比值減小(0.32±0.04 vs0.74±0.087,p<0.01)；1、5、10μmol/L MMI預(yù)處理組與模型組相比,其熒光強(qiáng)度比值明顯升高(0.45±0.051,0.41±0.031,0.38±0.035 vs0.32±0.04,p<0.05)。超微量ATPase測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞總ATPase活力,結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組總ATPase活力明顯降低(p<0.01)。MMI(1、5、10μmol/L)預(yù)處

12、理組與模型組相比,其ATPase活力明顯升高,且隨MMI濃度升高而增大(p<0.01,p<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞周期的變化,結(jié)果顯示,無(wú)論是正常組、模型組還是MMI預(yù)處理組,均對(duì)大鼠心肌細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.H2O2、CoCl2、Na2S2O4不同濃度作用相應(yīng)時(shí)間均可顯著降低心肌細(xì)胞存活率,造成心肌細(xì)胞不同機(jī)制的缺氧損傷。
　　 2.H2O2150μmol/L作用2h、CoCl

13、2500μmol/L和Na282O42mmol/L作用12h可造成模擬體內(nèi)心肌缺血損傷引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞損傷模型。
　　 3.甲胺鳶尾素可以改善H2O2所致心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,其機(jī)制與穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制線粒體膜電位下降,進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 4.MMI對(duì)正常心肌細(xì)胞周期沒(méi)有顯著影響。
　　 5.MMI增加缺氧損傷心肌細(xì)胞存活率,減少心肌細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與MMI抑制心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降和增