AdvmICOSIg阻斷ICOS共刺激通路對MLD-STZ誘導的T1D的治療作用.pdf

1、一、研究背景和目的 1型糖尿病(Type1Diabetes，T1D)是由自身免疫紊亂引起的糖尿病，其發(fā)病過程表現(xiàn)為兩個階段：首先是多種因素引起炎癥因子的分泌，導致局部淋巴細胞浸潤，引起胰腺炎；隨后發(fā)展為自身耐受被打破，活化后的CD4+T和CD8+T細胞攻擊自身β細胞，引起β細胞大部分死亡，導致胰島素分泌不足，血糖濃度過高而引起糖尿病。T細胞對β細胞的特異性殺傷是T1D發(fā)生的直接原因。 T細胞活化機制方面的研究發(fā)現(xiàn)T細胞的

2、有效活化和效應(yīng)發(fā)揮需要共刺激信號，缺乏共刺激信號的抗原刺激引起免疫耐受。針對已知的幾種共刺激分子(CD28、CD40L、CTLA-4等)的研究數(shù)據(jù)表明，缺乏共刺激分子或用適當?shù)氖侄巫钄喙泊碳ば盘柾緩?，T細胞不能有效的活化和增殖。鑒于共刺激分子對免疫應(yīng)答中的重要影響，其在自身免疫性糖尿病中的作用吸引了研究者的興趣。其中Arreaza,G.A等和Balasa,B等分別用CD28和CD40L阻斷性單抗治療NOD小鼠自發(fā)產(chǎn)生的糖尿病，發(fā)現(xiàn)這些試

3、劑對防止2-4周大的NOD小鼠發(fā)生胰腺炎和IDDM糖尿病有效，但對5-7周大的小鼠無效。這些結(jié)果提示當T1D表現(xiàn)出臨床癥狀時，CD28、CD40L等提供的共刺激信號并不重要，在維持著T細胞的殺傷效應(yīng)上，存在其他的共刺激途徑。 近年來，有關(guān)T細胞活化共刺激信號的研究取得了許多新進展。明確了B7-1/B7-2一CD28/CTLA-4和CD40L-CD40共刺激信號通路在激發(fā)初始T細胞活化中的主導地位，同時也發(fā)現(xiàn)，大部分效應(yīng)性CD8+

4、和CD4+T細胞的功能發(fā)揮和維持，以及記憶性T細胞發(fā)生再次應(yīng)答不依賴這兩條共刺激信號通路，體內(nèi)還存在其它共刺激信號通路。這些共刺激信號在T細胞應(yīng)答的不同時空階段，對T細胞的功能和效應(yīng)發(fā)揮著各自不同的調(diào)節(jié)作用。聯(lián)系到T1D發(fā)病時的特點，此時體內(nèi)已經(jīng)存在大量活化后的T細胞，干預上述共刺激途徑的局限性可能在于上述這些共刺激途徑只在初始T細胞的活化階段上發(fā)揮重要作用，而在記憶和效應(yīng)T細胞的功能發(fā)揮和維持階段上可能存在其他的途徑。最近，ICOS-

5、B7h信號通路在調(diào)節(jié)記憶性和效應(yīng)性T細胞功能、維持外周耐受方面的重要意義引起我們極大的關(guān)注。 ICOS(InducibleCOStimulate，誘導共刺激分子)是CD28家族的第3個成員，僅誘導性表達于活化的T細胞和記憶性T細胞。其配體ICOSL(B7h，B7RP-1)是B7家族成員，主要表達于B細胞和單核細胞?，F(xiàn)在認為效應(yīng)T細胞和記憶T細胞的功能發(fā)揮和維持依賴于ICOS的共刺激信號。ICOS的功能特點提示其在T細胞對β細胞的

6、殺傷過程中起重要作用，調(diào)節(jié)ICOS途徑可能可以調(diào)控T細胞對β細胞的殺傷。 基于以上分析，本研究擬首先建立MLD-STZ誘導的1型糖尿病小鼠的動物模型，觀察ICOS-B7h信號通路在1型糖尿病模型小鼠體內(nèi)的表達情況；然后構(gòu)建制備純化重組腺病毒AdvmICOSIg，觀察其對胰島細胞系NIT-1的感染能力，驗證mICOSIg的正確表達分泌，并用混合淋巴細胞反應(yīng)研究mICOSIg對淋巴細胞增殖的影響；在此基礎(chǔ)上，尾靜脈注射重組AdvmI

7、COSIg腺病毒，觀察AdvmICOSIg對MLD-STZ誘導的T1D病情的影響，并對其可能的機制進行了初步探討。 二、方法和結(jié)果 1.T1D動物模型的誘導和ICOS-B7h在T1D小鼠胰腺中的表達和意義：以40mg/kgSTZ對C57BL/6雄性小鼠進行連續(xù)5天的腹腔注射，采集血液測量血糖水平，以連續(xù)兩次血糖濃度高于12mmol/L為糖尿病小鼠，連續(xù)5周跟蹤檢測小鼠的血糖濃度及體重變化；檢測結(jié)果表明小鼠血糖濃度顯著增高

8、而體重明顯下降，且體征持續(xù)一個月，與文獻報道的STZ糖尿病小鼠模型一致。表明STZ在小鼠體內(nèi)成功誘導I型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。用RT-PCR、WB、IHC和FACS分別在mRNA和蛋白水平檢測ICOS和B7h的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著病程的發(fā)展，ICOS和B7h的表達顯著增加。 2.mICOSIg腺病毒的構(gòu)建、制備和純化及其活性的體外研究：通過酶切連接的方式將mICOSIg的表達框連入pAdtrack-CMV穿梭載體，后者在Adeas

9、y-1大腸桿菌中進行同源重組，隨后轉(zhuǎn)染293細胞進行病毒顆粒包裝。收集病毒后感染NIT-1細胞，用免疫印跡證實mICOSIg在NIT-1細胞中的正確分泌表達。大量擴增病毒后，利用膜吸附技術(shù)純化病毒，通過EGFP報告基因確定病毒滴度為3.16X1010/ml。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在混合淋巴細胞反應(yīng)，mICOSIg上清與對照比，能顯著抑制淋巴細胞增殖。 3.尾靜脈注射AdvmICOSIg，研究其對MLD-STZ誘導的TID的病情影響：M

10、LD-STZ誘導T1D后兩周，尾靜脈分別注射1X1O9AdvmICOSIg病毒和Adtrack對照病毒，3天后重復一次。每周檢測一次血糖、體重，結(jié)果表明注射AdvmICOSIg后1周小鼠血糖濃度即開始下降，到第21天最低，此后持續(xù)兩周均低于12mmol/1的糖尿病診斷標準。五周后處死，HE染色表明AdvmICOSIg組胰腺的炎癥細胞侵潤減少。第二次病毒注射后3天處死部分小鼠，收集全部血液，離心取血清，ELISA檢測mICOSIg的含量。

11、結(jié)果發(fā)現(xiàn)3倍比稀釋4次后，注射AdvmICOSIg腺病毒的小鼠血清mICOS含量仍高于對照組，提示尾靜脈注射AdvmICOSIg腺病毒后，mICOSIg在小鼠體內(nèi)分泌表達。 4.AdvmICOSIg影響T1D的可能機制：a)AdvmICOSIg腺病毒作用后，小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)CD4+D25+T細胞比例增加：同前用小劑量STZ作用5天，誘導建立MLD-STZ誘導的糖尿病小鼠模型后兩周，尾靜脈分別注射1X109AdvmICOSIg病毒

12、和Adtrack對照病毒，3天后重復一次。注射病毒后2周，取小鼠胰腺淋巴結(jié)，制備成單個細胞懸液后利用多色FACS檢測CD4+CD25+陽性細胞比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AdvmICOSIg作用后，胰腺淋巴結(jié)中CD4+CD25+陽性細胞比例增加。b)mICOSIg阻斷ICOS信號后減少了表達ICOS細胞的數(shù)量。利用FACS檢測AdmICOS處理后的小鼠PLN細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，AdvmICOSIg處理后，小鼠體內(nèi)ICOS+細胞顯著下降，說明A

13、dvmICOSIg抑制了體內(nèi)ICOS陽性細胞的產(chǎn)生。c)AdvmICOSIg腺病毒作用后，影響了小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)活化的T細胞的亞群分布。以胰腺淋巴結(jié)中ICOS陽性細胞為研究對象，多色FACS分析結(jié)果表明與對照組相比，AdvmICOSIg作用后ICOS陽性細胞中CD4陽性細胞比例增加，而CD4陰性細胞比例顯著下降。表明AdvmICOSIg作用后減少了CD8+亞群數(shù)量，通過抑制活化后的CD8效應(yīng)性T細胞的殺傷作用來保護胰島細胞。d)體外細胞

14、試驗表明，mICOSIg能促進淋巴細胞凋亡。體外細胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞活化后，與對照相比，mICOSIg上清促進凋亡的發(fā)生。說明AdmICOS可能通過分泌的mICOSIg來促進淋巴細胞凋亡，從而使體內(nèi)的ICOS陽性細胞數(shù)減少。 三、結(jié)論 1.在MLD-STZ誘導的T1D小鼠體內(nèi)，ICOS和B7h在胰腺淋巴結(jié)表達增加。而且B7h的表達可見于發(fā)病后的小鼠胰腺組織局部內(nèi)。提示ICOS-B7h信號通路可能參與了MLD-STZ

15、誘導后的糖尿病發(fā)病過程。 2.制備純化了重組AdvmICOSIg腺病毒，發(fā)現(xiàn)其可以有效感染NIT-1胰島細胞系，并可使后者分泌mICOSIg。利用混合淋巴細胞反應(yīng)證實分泌的mICOSIg能抑制淋巴細胞增殖。 3.MLD-STZ成功誘導小鼠發(fā)生T1D后，注射重組AdvmICOSIg腺病毒，可以在小鼠體內(nèi)表達分泌mICOSIg，胰腺組織局部可見重組AdvmICOSIg腺病毒感染后的細胞。而與對照組相比，注射重組AdvmICO

16、SIg腺病毒后能緩解糖尿病病情。 4.重組AdvmICOSIg腺病毒對糖尿病小鼠的保護機制可能在于腺病毒轉(zhuǎn)基因體內(nèi)表達分泌mICOSIg后，后者阻斷了ICOS-B7h信號通路，通過以下幾個方面產(chǎn)生保護作用：1)提高CD4+CD25+T細胞的比例；2)使胰腺淋巴結(jié)中活化后的T細胞由于缺乏ICOSB7h信號而因凋亡而死去；3)降低了活化后的發(fā)揮殺傷效應(yīng)的CD8+T細胞的相對比例，而提高了ICOS+CD4+細胞的比例。 5.本