體外共刺激阻斷模型中耐受T細胞對NK細胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機制初探.pdf

1、T淋巴細胞是機體細胞免疫的重要執(zhí)行和調(diào)節(jié)細胞。在組織器官移植細胞性免疫排斥反應(yīng)研究中，T細胞是最重要的研究對象。但研究表明，清除或抑制T細胞并不能誘導(dǎo)終生耐受，而種種跡象表明NK細胞在移植排斥反應(yīng)中占有非常重要的地位，若在器官移植前用抗NK1.1單抗去除NK細胞，可顯著延長異種移植物的存活時間。顯然，單純誘導(dǎo)T細胞耐受不足以完全克服移植排斥反應(yīng)，要誘導(dǎo)較長期甚至終生的免疫耐受還應(yīng)考慮其它參與排斥反應(yīng)的因素，如Mψ、NK細胞等。作為天然免

2、疫的重要組成,NK細胞是最早出現(xiàn)在移植局部的細胞之一，也是特異性細胞免疫的重要效應(yīng)細胞,NK細胞的功能狀態(tài)與器官移植的預(yù)后密切相關(guān)。作為免疫應(yīng)答的主要細胞之一,NK細胞既參與應(yīng)答的調(diào)節(jié)，其功能亦受多種因素的影響。 本實驗室在國家自然科學(xué)基金面上項目(30200261)資助下，在將同系小鼠胎胸腺與異種大鼠(F344)胎胸腺混合后移植給Balb/c裸小鼠，成功的建立了異種耐受模型。研究中發(fā)現(xiàn)在Balb/c裸小鼠上進行異種皮膚移植(F

3、344→nudemice)，20天左右即被排斥，而在事先接受混合胸腺移植的裸鼠上進行同樣的實驗則發(fā)現(xiàn)異種移植物存活時間顯著延長。顯然，在胸腺缺陷的裸鼠，存在非胸腺依賴方式，如NK細胞等排斥移植物，而這些途徑則可能被供體耐受的T細胞所抑制。有文獻提示，在胸腺移植耐受模型及阻斷CD28/B7共刺激通路誘導(dǎo)的移植耐受動物模型中,NK細胞的細胞毒性作用將在相當(dāng)一段時間內(nèi)受到抑制。那么,NK細胞的免疫抑制與T細胞的耐受之間到底有何聯(lián)系？其內(nèi)在機制

4、又是什么呢？ 免疫排斥反應(yīng)是一十分復(fù)雜的事件，在這一事件中除居于主導(dǎo)地位的T淋巴細胞外,NK細胞也起著非常重要的的作用。文獻及前文所述模型均提示我們，耐受的T細胞可能抑制或干預(yù)NK細胞的作用，為此，我們確定NK細胞作為研究對象，用抗CD80抗體阻斷CD28/B7信號通路建立體外近交系小鼠T細胞耐受模型，并通過該模型研究耐受T細胞對NK細胞功能可能的調(diào)控作用及其機制，包括影響NK細胞功能的主要T細胞亞群、APC細胞的影響及可能的分

5、子機制等。這不僅有利于進一步闡明T細胞及NK細胞耐受的機制，亦有可能對控制移植免疫排斥反應(yīng)提供新的思路，對深入了解器官移植中獲得性免疫與天然免疫間的相互關(guān)系有重大意義。我們將本項目研究獲得的主要結(jié)果和結(jié)論歸納如下： 一、實驗用細胞的獲得：用尼龍毛柱分離T淋巴細胞，利用MACS磁板分選裝置，分選CD4+T細胞及NK細胞。三種細胞的得率分別為10％、48.9％、3.42％；純度則分別達到90.04％、96.62％、86.3％。

6、 二、體外共刺激阻斷耐受模型的建立：當(dāng)體系中APC：T=1：3，總體積200μl,加入抗原至終濃度至10mg/ml,加入anti-CD80抗體至終濃度10mg/ml時可成功誘導(dǎo)T細胞對特定抗原的特異性低反應(yīng)。 三、我們首次發(fā)現(xiàn)：在體外，共刺共刺激阻斷誘導(dǎo)的耐受T細胞和抗原激活的T細胞均能抑制NK功能，細胞間直接接觸是其發(fā)揮抑制作用的主要方式。二者均經(jīng)抗原誘導(dǎo)，可能以相同機制對NK細胞進行抑制。 在體外反應(yīng)體系及其培養(yǎng)上

7、清中引入NK細胞，分組對經(jīng)48小時誘導(dǎo)的免疫耐受T細胞(APC+T+Ag+AntiCD80+NK)和抗原活化T細胞(APC+T+Ag+NK)進行實驗，以不添加抗原的實驗組(APC+T+NK)和不含T細胞的實驗組(NK+YAC-1)為對照，以51Cr標(biāo)記的YAC-1為靶細胞作標(biāo)準(zhǔn)81Cr4h釋放實驗檢測NK細胞功能。并利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)對T細胞與NK細胞的接觸情況作了進一步觀察。51Cr釋放率的結(jié)果顯示：耐受誘導(dǎo)組為21％，抗原激活

8、組為24.4％，細胞對照組為34％，無T細胞對照組為32％，各組上清中靶細胞51Cr釋放率分別為34％、31.6％、33.1％。上述結(jié)果表明耐受誘導(dǎo)的T細胞和抗原激活的T細胞均對NK細胞有顯著抑制作用 (P＜0.01)(21％vs32％,24.4％vs32％)而兩組之間無顯著性差異。各組上清與對照組間無顯著性差異。表明各組培養(yǎng)上清液對NK細胞的功能無顯著影響，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡下觀察到的NK細胞與T細胞的直接接觸，提示經(jīng)抗原誘

9、導(dǎo)的T細胞對NK細胞的功能抑制可能以細胞間的接觸機制為主。 四、抗原誘導(dǎo)的T細胞對NK細胞的抑制是APC非依賴的。進行T細胞誘導(dǎo)后，L-亮氨酸甲酯(終濃度為10mmol/L)去除APC細胞。利用標(biāo)準(zhǔn)4h51Cr釋放實驗觀察NK細胞的功能狀況。結(jié)果表明：T細胞經(jīng)誘導(dǎo)后，無論是否去除APC細胞均對其抑制NK細胞無顯著性影響。經(jīng)抗原誘導(dǎo)的APC單獨存在對NK細胞的功能無影響，也不能通過T細胞影響NK細胞的活性。 五、CD4+T

10、細胞是影響NK細胞功能的主要細胞亞群，且至少部分是Treg非依賴性的。 在利用標(biāo)準(zhǔn)4h51Cr釋放實驗觀察體外共刺激阻斷耐受模型中NK細胞功能的抑制實驗體系中，T細胞并非為均一細胞群體，為了解不同T細胞亞群與NK細胞抑制的關(guān)系可能為深入的機制探討提供線索。我們分別探討了CD4+CD25+T亞群、CD4+CD25-T亞群及CD4-T亞群對NK功能的影響，結(jié)果表明：CD4+CD25+T細胞對NK細胞有顯著性抑制作用。抗原誘導(dǎo)后的CD

11、4+CD25-T細胞群體對NK的功能亦有顯著的抑制，而CD4-群體則未表現(xiàn)出這一特性。 六、多克隆刺激劑激活的T細胞也可以細胞間接觸方式抑制NK細胞活性，但其影響NK細胞功能的機制可能不同于抗原誘導(dǎo)的T細胞。 前面的實驗探討了抗原激活的T細胞對NK功能的抑制作用，發(fā)現(xiàn)無論是否用AntiCD80進行共刺激阻斷，均不影響T細胞對NK的抑制，那么抗原是否是引起NK細胞抑制的前提條件？為此，本文還探討了多克隆刺激劑ConA與An

12、tiCD3對T細胞抑制能力的影響，并做了動態(tài)觀察。結(jié)果如下：從T細胞接受刺激24h起至96h，ConA刺激組與AntiCD3刺激組與NK細胞接觸的T細胞均表現(xiàn)了抑制NK細胞功能,48h后，耐受誘導(dǎo)組與抗原激活組T細胞表現(xiàn)出顯著的對NK細胞功能的抑制效應(yīng)。而24h、48h、72h各時相點各組上清液對NK功能均無顯著影響。顯然，活化的T細胞均可以細胞接觸的方式抑制NK細胞的功能。 上述結(jié)果還表明多克隆激活劑對T細胞的影響快，從誘導(dǎo)后

13、24h既表現(xiàn)出對NK的抑制，且持續(xù)時間較長，至少可持續(xù)96h。而耐受誘導(dǎo)組與抗原激活組T細胞卻在誘導(dǎo)48h后，方表現(xiàn)出顯著的對NK細胞功能的抑制效應(yīng)，我們的結(jié)果還發(fā)現(xiàn)到96h后，兩組上清液對NK細胞的殺傷能力還表現(xiàn)出促進作用。顯然不同的激活劑影響下，T細胞可能以并不完全相同的機制來調(diào)控NK細胞的行為。 七、小鼠bc-1與bc-2分子的表達可因抗原的誘導(dǎo)而產(chǎn)生，是抗原誘導(dǎo)的T細胞抑制NK功能的重要因素之一。 HLA-G或小

14、鼠bc-1與bc-2的表達是T細胞抑制NK細胞活性的可能分子基礎(chǔ)之一。bc1,bc2是小鼠胚囊或胎盤滋養(yǎng)層細胞上表達的非經(jīng)典MHC-I類分子，與人HLA-G類似，一般認為該分子可抑制NK細胞功能。通常成熟的淋巴細胞不表達該分子。但在某些特殊條件下，如抗原的刺激下又如何呢？以F9細胞株為陽性對照作RT-PCR,觀察不同T細胞激活劑——ConA、Anti-CD3、同種異體淋巴細胞抗原等作用下,24h,48h,72h及96h小鼠淋巴細胞bc1

15、,bc2的表達情況。結(jié)果表明抗原刺激48hT細胞可檢出bc1,bc2。其他時相、其他多克隆細胞激活劑作用下均未能檢出bc1,bc2的表達。提示bc1,bc2可能是抗原誘導(dǎo)的T細胞抑制NK功能的主要因素之一。 八、首次提出多克隆刺激劑ConA與AntiCD3對T細胞抑制NK細胞能力的影響機制存在bc-1與bc-2非依賴途徑。鑒于多克隆T細胞激活劑ConA及Anti-CD3誘導(dǎo)的活化T細胞并不表達bc-1與bc-2,則其下調(diào)NK細胞