ICOS-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植急、慢性排斥反應(yīng)中作用研究.pdf

1、背景：臨床上同種異體排斥反應(yīng)仍然是器官移植的主要障礙，器官移植患者幾乎無一例外地要長(zhǎng)期、正規(guī)地應(yīng)用免疫抑制劑。同種異體排斥反應(yīng)的實(shí)質(zhì)是T細(xì)胞活化，經(jīng)典移植免疫學(xué)理論認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào)。信號(hào)1為抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)表面的主要組織相容性抗原／外源性抗原復(fù)合物(MHC／Ag complex)，與T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體／CD3復(fù)合物(TCR／CD3 complex)相結(jié)合；信號(hào)

2、2為APC或B細(xì)胞表面的共刺激抗原分子與其配體的相結(jié)合(共刺激通路)。在共刺激通路中，起主要作用的是B7-CD28／CTLA4和CD40-CD154信號(hào)途徑。CTLA4在T細(xì)胞活化后迅速上調(diào)表達(dá)，并對(duì)T細(xì)胞起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。研究表明，如果缺乏共刺激信號(hào)，TCR介導(dǎo)的抗原信號(hào)刺激會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無能，T細(xì)胞無法分泌IL-2即T細(xì)胞無法進(jìn)入活化、增殖階段。 盡管大量的證據(jù)表明，CD28分子在啟動(dòng)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中提供了關(guān)鍵的共刺激信號(hào)，然而

3、并非所有情況下T細(xì)胞活化都依賴于B7-CD28信號(hào)。研究表明，CD28<-/->小鼠仍能對(duì)同種異體移植皮膚發(fā)生排斥反應(yīng)。阻斷CD40-CD154交聯(lián)也不能完全抑制同種異體小鼠心臟移植排斥反應(yīng)。近年來研究表明，CD8<'+>T細(xì)胞不依賴CD28或CD154提供的共刺激信號(hào)仍可以繼續(xù)得以活化，說明在T細(xì)胞的活化中還可能存在其他共刺激分子或共刺激信號(hào)途徑。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，B7／CD28家族其他成員也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)?？烧T導(dǎo)

4、共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)是B7／CD28家族新成員，盡管ICOS分子與CD28和CTLA4分子在結(jié)構(gòu)上具有同源性(在大鼠，ICOS與CD28和CTLA4分別具有19％和13％相同的氨基酸序列)，但不同于CD28分子，ICOS分子并不在T細(xì)胞表面持續(xù)表達(dá)，僅表達(dá)于活化T細(xì)胞表面，其作用機(jī)制也不相同，并不能與CD28和CTLA4的配體結(jié)合。B7家族新成員B7h，B7RP-1，GL50或ICOSL為

5、ICOS分子的配體。ICOS分子可能加強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)外來抗原的反應(yīng)，包括細(xì)胞增殖、淋巴因子的分泌，細(xì)胞間粘附分子的上調(diào)、加強(qiáng)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和維持或調(diào)節(jié)記憶性T細(xì)胞的功能。ICOS信號(hào)通路可增強(qiáng)鼠和人類T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生，而且CD28共刺激信號(hào)可加強(qiáng)ICOS分子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化。Coyle等認(rèn)為ICOS分子是活化T細(xì)胞的一個(gè)重要受體，使T細(xì)胞向Th2而不是向Th1效應(yīng)細(xì)胞分化。因此，抑制ICOS分子能有效的抑制活化

6、T輔助細(xì)胞功能，從而抑制IL-4和INF-γ的分泌。盡管CD28／B7對(duì)免疫反應(yīng)的啟動(dòng)具用重要作用，而ICOS分子與其配體結(jié)合在后期免疫反應(yīng)和二次免疫反應(yīng)中占主要作用。ICOS分子也是一個(gè)重要的粘附分子，其粘附一支持能力與CD28相比有顯著差別，ICOS分子可引起強(qiáng)烈的細(xì)胞間粘附。這暗示ICOS分子在構(gòu)建"免疫突觸"中發(fā)揮重要的作用。 本研究應(yīng)用大鼠腹腔內(nèi)異位心臟移植模型,通過應(yīng)用病理學(xué)、RT-PCR,EUSA、免疫組化、免疫熒

7、光流式細(xì)胞技術(shù)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,探索ICOS分子途徑在同種異體移植物排斥反應(yīng)中的表達(dá)情況及意義。同時(shí)探索抑制ICOS-B7RP-1共刺激通路對(duì)大鼠同種異體心臟移植急性和慢性排斥的影響及其可能的機(jī)制。 第一章大鼠腹腔異位心臟移植模型的建立 目的：建立簡(jiǎn)便易行的大鼠腹腔異位心臟移植模型,總結(jié)制作大鼠腹腔異位心臟移植模型的體會(huì)。 方法：低溫灌注后切取供體心臟,分離出受體腎動(dòng)脈平面以下的下腔靜脈和腹主動(dòng)脈,將供心主動(dòng)脈與受

8、體腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合,供心肺動(dòng)脈與受體下腔靜脈端側(cè)吻合。術(shù)后觀察移植心的存活情況,移植心心跳停止后,切取移植心,病理學(xué)檢查確定排斥情況。 結(jié)果：通過2個(gè)月的手術(shù)訓(xùn)練,成功建立了穩(wěn)定的大鼠腹腔異位心臟移植模型。供心缺血時(shí)間35±7分鐘,手術(shù)成功率82[％]。 結(jié)論：手術(shù)成功的關(guān)鍵:①麻醉及肝素化劑量合適;②供心的灌注及保護(hù),縮短供心缺血時(shí)間;③提高血管吻合質(zhì)量和速度,減少出血;④術(shù)后保溫,及時(shí)補(bǔ)充液體。 第二章ICO

9、S-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)中作用研究 目的：研究ICOS分子在大鼠同種異體心臟移植模型中的組織表達(dá)以及阻斷ICOS-B7RP-1通路對(duì)移植心的保護(hù)作用。 方法：建立大鼠異位腹腔心臟移植模型,設(shè)同基因移植組、以未處理和無關(guān)抗體干預(yù)大鼠為對(duì)照組和抗.-ICOS治療大鼠為實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后取出移植心臟行組織病理學(xué)檢查,移植心臟內(nèi)ICOS分子的表達(dá)(免疫組化),ICOS、B7RP-1、IL-2、IL-

10、4、IL-10、INF-γmRNA表達(dá)的測(cè)定[逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法],CD4<'+>與CD8<'+>T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(免疫熒光抗體法)檢查,同時(shí)檢測(cè)外周血IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ細(xì)胞因子水平變化[酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法]和脾臟淋巴細(xì)胞CD25和ICOS表達(dá)[流式細(xì)胞測(cè)定技術(shù)(FACS)],余下的動(dòng)物觀察移植心臟存活時(shí)間。 結(jié)果：(1)同基因移植組大鼠及移植心均獲得長(zhǎng)期存活(>100d),實(shí)驗(yàn)

11、組移植心臟存活時(shí)間(16.5±1.51)d,其他對(duì)照組分別為(6.86±1.35)d、(6.63±1.06)d(P<0.05);(2)同基因移植組各個(gè)時(shí)間段移植心病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)排斥現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，術(shù)后3、5、7天心肌淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后5天急性排斥反應(yīng)為2級(jí)，而對(duì)照組均為3A～4級(jí)；(3)實(shí)驗(yàn)組移植物內(nèi)ICOS、IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(術(shù)后5天)，而其他對(duì)照組顯著上

12、調(diào)，實(shí)驗(yàn)組外周血IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ高峰延遲；(4)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第5天移植物內(nèi)CD4<'+>、CD8<'+>T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，ICOS分子的表達(dá)幾乎完全受抑制，與其他對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(6)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第7天受體脾臟CD4和CD8細(xì)胞表面CD25和ICOS表達(dá)明顯減低(P<0.05)。結(jié)論 阻斷ICOS-B7RP-1共刺激信號(hào)通路可以保護(hù)同種異體移植心臟，推遲和減輕移植心臟急性排斥反應(yīng)

13、的發(fā)生，延長(zhǎng)移植心臟的生存時(shí)間。 第三章I COS-B7RP-1共刺激通路在大鼠同種異體心臟移植慢性排斥反應(yīng)中作用研究 目的：研究阻斷ICOS-B7RP-1共刺激通路對(duì)慢性排斥反應(yīng)(CR)的抑制作用，并探討其可能的作用機(jī)制。 方法：建立大鼠異位腹腔心臟移植模型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：A組：同基因移植組；B組：同種異體移植組(急性排斥組)，未給予任何治療；C組：慢性排斥組，CsA 10.0 mg·kg<'-1>灌胃，

14、連續(xù)60天；D組：實(shí)驗(yàn)組，CsA10.0 mg.kg<'-1>.d<'-1>灌胃，連續(xù)60天，同時(shí)抗-ICOS單抗2mg／kg腹腔注射，2次／周腹腔注射至術(shù)后60天。觀察移植心臟存活天數(shù)，術(shù)后5天和移植心存活超過100天時(shí)分別取移植心和受體脾臟檢測(cè)ICOS表達(dá)，移植心存活超過100天時(shí)進(jìn)行組織學(xué)檢查并檢測(cè)其受體外周血CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例。 結(jié)果：(1)A組大鼠及移植心均獲得長(zhǎng)期存活(>100)d，B、C

15、、D組大鼠移植心臟存活時(shí)間分別為(6.86±1.35)d、(93.75±6.13)d和(>100)d，與B組相比，治療組大鼠心臟存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有顯著性意義(P<0.05)，D組與C組相比有顯著性差異(P<0.05)；(2)術(shù)后第5天D組與B組、C組比較其移植心和受體脾臟內(nèi)ICOS表達(dá)明顯減低，而B組與C組比較，其移植心臟內(nèi)ICOS表達(dá)明顯降低，而受體脾臟內(nèi)ICOS表達(dá)明顯無顯著變化，術(shù)后100天D組與C組比較，其移植心臟和受體脾

16、臟內(nèi)ICOS表達(dá)均明顯降低；(3)術(shù)后100天A組各個(gè)時(shí)間段移植心病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)排斥現(xiàn)象，僅見少許心肌纖維化，D組與C組相比，移植心慢性排斥損傷明顯減輕，而且3／7未見明顯的慢性排斥損傷，其血管內(nèi)膜炎、血管狹窄評(píng)分顯著低于C組(P<0.05)；(4)D組與C組相比外周血CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。 結(jié)論：阻斷ICOS-B7RP-1共刺激通路具有明顯的抗移植物慢性排斥損傷作用，其作用