蕓豆AFLP分子標(biāo)記體系的建立及其適宜重慶低海拔地區(qū)種植的品種篩選.pdf

1、AFLP(Amplifled fragment length polymorphism)是一種新型的分子標(biāo)記技術(shù)，目前已廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)及動(dòng)植物育種等領(lǐng)域的研究。盡管已有研究者利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蕓豆(Phaseolus vularis L.)進(jìn)行了一些研究，但利用AFLP技術(shù)進(jìn)行研究的還是很少。故本研究對(duì)影響AFLP技術(shù)體系的多方面因素進(jìn)行了探討，確定了適合蕓豆基因組DNA的AFLP分子標(biāo)記體系，以期為蕓豆的分子遺傳圖譜的構(gòu)建、目

2、標(biāo)基因的定位和核心種質(zhì)的確立提供參考。 AFLP是由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)明的。它結(jié)合了RFIJ及RAPD的優(yōu)點(diǎn)，方便快速，只需要極少量DNA材料，不需要Southern雜交，不需要預(yù)先知道DNA的序列信息，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量的信息，而且再現(xiàn)性高，重復(fù)性好。因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制，遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究。在一些多態(tài)性很少，而且待測(cè)樣品較少的情況下(如近等基因系和BSA分析)，用AF

3、LP分析能達(dá)到滿(mǎn)意的結(jié)果。高密度基因圖譜的繪制或?qū)δ硞€(gè)基因所在區(qū)域的精細(xì)作圖，AFLP是較為理想的方法。AFLP技術(shù)目前不僅在小麥、水稻、玉米、大豆和棉花等主要作物上得以應(yīng)用，而且在蔬菜(馬鈴薯、番茄、鷹嘴豆等)、林木(垂枝樺、輻射松)以及擬南芥上廣泛應(yīng)用。以上多數(shù)作物的研究結(jié)果均表明，AFLP所產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項(xiàng)技術(shù)。 AFLP分析步驟多，流程長(zhǎng)，對(duì)

4、操作人員的素質(zhì)要求較高。因此掌握技術(shù)關(guān)鍵，優(yōu)化反應(yīng)條件對(duì)穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果、提高工作效率尤為重要。 本研究以AFLP標(biāo)記技術(shù)的主要技術(shù)關(guān)鍵及其優(yōu)化措施的幾個(gè)方面入手，建立了成熟的蕓豆DNA的AFLP分析體系。 主要結(jié)果如下： 1.通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，摸索出適用于蕓豆提純的方法，所提純的DNA純度高，適于AFLP等的試驗(yàn)研究； 2.通過(guò)對(duì)內(nèi)切酶用量、酶切時(shí)間、連接時(shí)間、稀釋倍數(shù)等的研究，建立了適于蕓豆DNA分析的AFL

5、P銀染技術(shù)體系。在25μL的酶切連接體系中，含純化的蕓豆DNA250ng，T4Ligase1.5U，T4Buffer 3.5βL，EcoR I 3U，Mse I 3U，EcoR I adapter 5pmol，Mse I adapter50pmol，加入ddH2O至25μL,37℃，酶切4h；加入接頭后，37℃連接8h以上(或過(guò)夜)：連接產(chǎn)物稀釋5倍后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增；預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋5倍后再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增：加5βL Loadingbuffer

6、，95℃變性10min，立即冰浴；在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析；銀染法檢測(cè)RCR產(chǎn)物。 3.運(yùn)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)的方法，對(duì)蕓豆進(jìn)行分析研究，通過(guò)比較Mse I單酶切、EcoR I單酶切，Mse I-EcoR I雙酶切不同酶切組合的效果，結(jié)果表明Mse I-EcoR I雙酶切組合較容易找到多態(tài)性引物組合，而且具有較高的多態(tài)性，本試驗(yàn)選用Mse I-EcoR I雙酶切組合進(jìn)行雙酶切蕓豆基因組DNA從而完成A

7、FLP的分析工作，試驗(yàn)用16對(duì)Mse I-EcoR I引物進(jìn)行標(biāo)記分析； 4.并且經(jīng)過(guò)初步篩選，選出具有較好多態(tài)性的引物組合； 5.經(jīng)統(tǒng)計(jì)，用這8對(duì)引物共擴(kuò)增1774條帶條，其中多態(tài)性條帶475條，充分證明了擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)方法所得的多態(tài)性極高，這為后續(xù)對(duì)蕓豆基因的標(biāo)記研究奠定了基礎(chǔ)。 通過(guò)兩年的產(chǎn)量試驗(yàn)，篩選出3個(gè)品種(系)，分別是小黑蕓豆、LS-141-1、LRK333產(chǎn)量高而且而且經(jīng)濟(jì)性狀都比