柚(citrus grandis Osbeck)單染色體AFLP分子標(biāo)記體系及文庫的建立.pdf

1、柚是我國重要的水果。柚遺傳背景較復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，一直以來難以建立精確的物理圖譜，這為進(jìn)行柚基因組學(xué)的研究、分子標(biāo)記輔助育種以及克隆一些重要的園藝性狀基因造成了困難，染色體微分離弄口微克隆技術(shù)的應(yīng)用為柚類遺傳學(xué)的研究提供了新的思路。針對柚單染色體極小，形態(tài)辨別和微分離困難，本試驗(yàn)采用隨機(jī)微分離的方法，通過LA-PCR-AFLP技術(shù)對染色體進(jìn)行同源劃分，并使用Southern雜交技術(shù)對單染色體微克隆質(zhì)量和同源劃分的正確性進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。最

2、后將各同源單染色體文庫合并，能大大提高同源染色體文庫的覆蓋度，如果將各類同源染色體文庫合并，則建立了整個(gè)柚染色體文庫。
　　 1、對柚染色體的制片和微分離技術(shù)進(jìn)行了研究。比較了壓片-液氮速凍揭片法和懸液法制片的優(yōu)劣；優(yōu)化了纖維素果膠酶的濃度比例和酶解時(shí)間：2％5f維素酶和1％果膠酶，酶解1 h；比較了卡寶品紅和鐵釩蘇木精兩種染色方法，并最終選用了卡寶品紅染色法；對玻璃針的制備、分離方法進(jìn)行了選擇和改進(jìn)。良好的制片效果大大提高了單

3、染色體顯微分離的質(zhì)量和效率。
　　 2、針對柚單染色體微克隆受外源污染干擾嚴(yán)重的情況，通過對比試驗(yàn)，對柚單染色體LA-PCR-AFLP技術(shù)體系中外源DNA污染問題中不同試驗(yàn)用水、加接頭連接前后步驟對水污染的敏感度以及LA-PCR形成的非特異性亮帶現(xiàn)象進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：8種試驗(yàn)用水中BT水（Bioteke，RNase-free and DNase-freeWater）最佳；水的質(zhì)量對LA-PCR過程中接頭連接之前的步驟影響最大

4、，對加接頭之后的步驟也有一定的影響；非特異性亮帶為引物自連形成的多聚體，與外源污染無關(guān).同時(shí)試驗(yàn)了Southern雜交對柚單染色體LA-PCR過程中外源污染程度的檢測，及細(xì)胞質(zhì)污染的影響等。本試驗(yàn)通過對外源污染的來源和關(guān)鍵步驟實(shí)施嚴(yán)格防控，經(jīng)過dot blot驗(yàn)證，使外源污染能夠得到有效控制。這為建立高質(zhì)量的柚單染色體文庫奠定了基礎(chǔ)。
　　 3、針對柚葉片多糖的情況，通過3種基因組DNA提取方法比較，最終選用SDS-KAC法并獲

5、得了較高質(zhì)量的柚基因組DNA；對酶切時(shí)間和ATP濃度對連接反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究，證明1-5 h均能滿足單染色體的酶切需要，但是為保證不同單染色體擴(kuò)增結(jié)果的一致性，最后選擇較長的酶切時(shí)間4-5 h；ATP連接終濃度在大于5 mM的時(shí)候可能抑制連接反應(yīng)，而在制接頭的時(shí)候不額外添加ATP也不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成太大影響；顯微分離了166個(gè)柚單染色體，并通過dot-blot雜交和Southern印跡雜交進(jìn)行了驗(yàn)證，從中篩選出信號(hào)較強(qiáng)的55個(gè)單染色體

6、用于進(jìn)一步試驗(yàn)。對柚單染色體LA-PCR-AFLP技術(shù)體系中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：退火溫度較高的程序TD3（退火梯度：72℃→65℃30 s（-0.5℃/cyc））擴(kuò)增效果較好；稀釋100倍（10 ng）為最適模板量；篩選出了擴(kuò)增多態(tài)性較好的10組引物對；最終建立了5張不同引物對組合擴(kuò)增的柚不同單染色體的AFLP-SDS-PAGE指紋圖譜。
　　 4、獲得了高質(zhì)量的官溪蜜柚總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，經(jīng)LA-PC

7、R過程，獲得cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后與pMD18-T-vector載體連接，進(jìn)行T-A克隆，獲得大量cDNA文庫片段的克隆子.從其中隨機(jī)選擇134個(gè)克隆子經(jīng)純化后用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　 5、建立了適用于柚單染色體同源鑒定的dot-blot雜交體系：1）探針制備時(shí)DIG-High Prime（vial1）的用量可減少為2.5μL；2）單染色體嚴(yán)格純化后制作探針，探針制成后不用再純化；3）使用柚單染色體第一輪LA-PCR產(chǎn)

8、物制作探針效果較好；4）柚單染色體差異片段和柚cDNA擴(kuò)增文庫片段必須經(jīng)純化后作為模板；5）當(dāng)使用柚單染色體探針進(jìn)行dot-blot雜交時(shí)，柚單染色體文庫、差異片段、柚cDNA擴(kuò)增文庫片段模板的上樣量應(yīng)小于1 ng。
　　 6、對5對引物擴(kuò)增的AFLP-SDS-PAGE指紋圖譜多態(tài)性片段的聚類分析，初步把55條單染色體體劃分為10類；將這10類染色體分別與134個(gè)cDNA擴(kuò)增文庫克隆子進(jìn)行dot-blot雜交，驗(yàn)證了不同單染色體

9、篩選cDNA克隆文庫進(jìn)行同源性劃分的可行性。通過進(jìn)一步的Southern雜交驗(yàn)證，確保了同源劃分的正確性。
　　 本試驗(yàn)對柚單染色體進(jìn)行了初步的同源劃分和建立了同源染色體文庫，并經(jīng)過Southern雜交驗(yàn)證和鑒定。但染色體文庫的完整性和質(zhì)量可能仍然不夠高，需要不斷的進(jìn)行修彌補(bǔ)和修正。若要建立比較完整和高質(zhì)量的文庫，還要做大量的補(bǔ)充和驗(yàn)證工作。
　　 單染色體文庫的建立為以后建立柚精確物理圖譜奠定了基礎(chǔ)，對于進(jìn)一步進(jìn)行柚基