鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子治療表淺性膀胱癌的實驗研究.pdf

1、鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位錨定治療表淺膀胱癌的方法目前尚無相關(guān)報道。本研究將鏈親和素標(biāo)記的細(xì)胞因子錨定于細(xì)胞表面，探求該方法的可行性與有效性，為鏈親和素標(biāo)記的雙功能蛋白分子治療表淺膀胱癌提供一定的實驗依據(jù)。研究內(nèi)容分為三部分：第一部分鏈親和素標(biāo)記的蛋白與細(xì)胞、組織的錨定；第二部分建立小鼠原位表淺膀胱癌模型及模型生物特性觀察；第三部分鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）

2、原位錨定小鼠膀胱治療膀胱癌療效的初步觀察。 第一部分鏈親和素標(biāo)記的蛋白與細(xì)胞、組織的錨定。 1.1,研究目的: 鏈親和素標(biāo)記的綠色熒光蛋白（SA-GFP）體外錨定MB49細(xì)胞，觀察錨定率；鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位錨定小鼠膀胱，觀察錨定的效果及錨定量與時間關(guān)系。 1.2,研究方法: 1、將MB49細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用0.25％胰蛋白酶消化后PBS洗三次

3、，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入300μl NHS-PEO4一Biotin（1mg/ml），混勻后室溫作用0.5h，PBS洗3次×5 min；加入1000μl SA-GFP（0.15mg/ml），混勻后室溫作用0.5h，PBS洗3次×5 min；充分混勻，在熒光顯微鏡下觀察，計算錨定率。隨機取5個非重疊視野計算平均值。 錨定率=熒光下細(xì)胞數(shù)/自然光下細(xì)胞數(shù)×100％ 2、雌性C57BL/6小鼠12只，隨機分成2組，

4、每組6只，實驗組小鼠用PBS灌洗膀胱后灌注100μl NHS-PEO4-Biotin（1mg/ml）進行生物素化30分鐘，再次PBS灌注沖洗掉多余生物素，然后膀胱灌注100μl SA-GM-CSF（0.15mg/ml），留置靜脈留置針1小時；對照組小鼠PBS膀胱灌注，然后膀胱灌注100μlSA-GM-CSF（0.15mg/ml），留置靜脈留置針1小時。分別在灌注后第1、4、7天處死小鼠每組2只，取膀胱做冰凍切片免疫組化分析。 1

5、.3研究結(jié)果: 1、熒光顯微鏡下觀察可見MB49細(xì)胞基本被鏈親和素標(biāo)記的綠色熒光蛋白（SA-GFP）錨定，錨定率為98.78％。 2、冰凍切片免疫組化分析結(jié)果顯示實驗組小鼠膀胱粘膜有特異性（陽性）顯色（棕黃色），提示鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）錨定在小鼠膀胱粘膜表面；顯色以第1天最濃，以后逐日變淡，至第7天仍可見較明顯染色；對照組小鼠膀胱粘膜無陽性顯色或僅有少許非特異染色。 1

6、.4,研究結(jié)論: 以上體外和體內(nèi)實驗分別從細(xì)胞和組織的水平驗證了鏈親和素標(biāo)記的細(xì)胞因子可以錨定在細(xì)胞表面，并且錨定效率高（錨定率為98.78％）、保持時間長（可保留七天左右）。 第二部分 C57BL/6小鼠原位表淺膀胱癌模型的建立及模型生物特性觀察。 1.1,研究目的: 以簡便的方法建立重復(fù)性、可靠性較好的C57BL/6小鼠原位表淺膀胱癌模型，觀察其生物學(xué)特性，驗證其用于評價治療性實驗研究的可行性。

7、 1.2,研究方法: 雌性C57BL/6小鼠150只，隨機分成5組，每組30只。分別為： A.膀胱粘膜未預(yù)處理組; B.膀胱粘膜預(yù)處理表淺模型觀察組; C.膀胱粘膜預(yù)處理絲裂霉素治療組; D.膀胱粘膜預(yù)處理PBS治療對照組; E.膀胱粘膜預(yù)處理不治療生存期觀察組; 1.2,研究結(jié)果: 1、成功地建立了可靠性和重復(fù)性均好的小鼠原位表淺膀胱癌模型，膀胱粘膜處理的時間

8、以酸20s堿5s較合適。膀胱粘膜未預(yù)處理組全部未見成瘤，膀胱粘膜預(yù)處理組全部成瘤。 2、成瘤小鼠病理切片結(jié)果顯示：第7～9天膀胱粘膜層可見少量癌細(xì)胞；第10～16天可見膀胱癌細(xì)胞主要在膀胱粘膜、粘膜下及淺肌層生長，同時也向腔內(nèi)生長并且逐日增多；第19～28天在肌層廣泛浸潤（包括深肌層）；第31天可見侵及漿膜層。建模小鼠膀胱癌發(fā)生率100％（60/60），其中腎轉(zhuǎn)移20％（12/60），肺轉(zhuǎn)移5％（3/60），未見輸尿管、心、肝、

9、脾轉(zhuǎn)移。成瘤小鼠不治療與用PBS膀胱灌注治療膀胱腫瘤生長情況相似。未治療成瘤小鼠大多于20至30余日死亡。 3、經(jīng)過6次膀胱灌注治療，絲裂霉素組膀胱腫瘤重量與對照組相比有顯著性差異（t=14.153，P=0.000），絲裂霉素抑瘤率為47.08％。 1.3,研究結(jié)論: 較為簡便的方法成功地建立了可靠性和重復(fù)性均好的小鼠原位表淺膀胱癌模型，成瘤率為100％；該模型腫瘤為移行細(xì)胞癌，大多數(shù)為表淺性腫瘤，早期主要在膀胱

10、粘膜層生長，以后逐漸向粘膜下層、肌層浸潤生長以及向膀胱腔內(nèi)生長；絲裂霉素治療有效；小鼠的一般情況、病情進展情況以及病理學(xué)表現(xiàn)都與人的膀胱移行細(xì)胞癌十分相似；為表淺膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的防治研究尤其是抗癌藥物的篩選和免疫治療研究提供了理想的動物實驗?zāi)Ｐ汀?第三部分 SA-GM-CSF原位錨定小鼠膀胱治療膀胱癌療效的初步觀察。 1.1,研究目的: 鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位錨定成瘤

11、小鼠膀胱，探求該新療法的可行性和有效性。 1.2,研究方法: 1、雌性C57BL/6小鼠50只，隨機分成5組，每組10只，其中4組按照上述方法建立原位表淺膀胱癌模型，分為PBS組、GM-CSF組、SA-GFP組和SA-GM-CSF組；另外1組為二次攻擊對照組，正常飼養(yǎng)3周后，與SA-GM-CSF組一起同時接受MB49細(xì)胞膀胱灌注，建立原位表淺膀胱癌模型。 2、除二次攻擊對照組外，其余各組（即PBS組、GM-CSF

12、組、SA-GFP組和SA-GM-CSF組）在灌注MB49膀胱癌細(xì)胞后第1天，開始分別給予PBS、GM-CSF、SA-GFP和SA-GM-CSF膀胱灌注治療，隔3天一次，連續(xù)6次。 3、六次治療結(jié)束后，SA-GM-CSF組和二次攻擊對照組小鼠同時接受MB49細(xì)胞膀胱灌注。 4、所有小鼠觀察一般情況（精神狀態(tài)、飲食、體質(zhì)量等）、腫瘤生長情況（是否成瘤、腫瘤大小、有無血尿、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）和生存期，并對死亡小鼠進行解剖，留取膀胱、

13、腎、輸尿管、心、肝、肺、脾等組織用10％福爾馬林固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片、漂片、烤片、脫蠟、染色（HE染色）后做病理切片（連續(xù)切片，厚度5μm），必要時做免疫組化染色。 5、小鼠生存期采用生存分析（Survival），生存期比較采用Kaplan-Meier法Log rank檢驗，進行整體比較差異顯著，再進行水平間的兩兩比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。 1.3,研究結(jié)果: 1、觀察至第60天，PBS組

14、小鼠因腫瘤生長全部死亡，有2只出現(xiàn)腎轉(zhuǎn)移；GM-CSF組有1只存活，膀胱可觸及較大腫塊；SA-GFP組有2只存活，膀胱均可觸及較明顯腫塊； SA-GM-CSF組有7只小鼠存活，其中1只小鼠膀胱可觸及較小腫塊，6只小鼠一直無瘤生長。 2、PBS組小鼠一般第7～9天可觸及膀胱小腫塊，第17天左右出現(xiàn)肉眼血尿，20d后體質(zhì)量逐漸下降，精神狀態(tài)漸差，并于第20天后陸續(xù)死亡；SA-GM-CSF組第16～20天先后有4只小鼠可觸及膀胱小腫塊

15、；與PBS組小鼠比較，生存時間長、相對較為活潑。 3、鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）膀胱原位錨定治療組（實驗組）與其它各組比較，小鼠腫瘤出現(xiàn)的時間晚、腫瘤生長速度慢；各組小鼠生存期整體比較有顯著性差異（X2=56.301，P=0.000），進行水平間的兩兩比較，SA-GM-CSF組與PBS組、GM-CSF組和SA-GFP組相比均有顯著性差異（X2值、P值分別為：X2=21.837，P=0.000

16、；X2=8.589，P=0.003；X2=5.188，P=0.023）。 4、MB49細(xì)胞二次攻擊后，SA-GM-CSF組與對照組相比，生存期有顯著性差異（X2=9.551，P=0.002）。SA-GM-CSF組有7只小鼠存活（7/10），其中6只小鼠一直無瘤生長，而對照組僅有1只存活（1/10）且膀胱有較大腫瘤生長。 1.4,研究結(jié)論: 鏈親和素標(biāo)記的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（SA-GM-CSF）原位錨定于