豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子在干酪乳桿菌中的表達(dá)及生物活性的檢測.pdf

1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是一種非常重要的促進(jìn)造血細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子，它主要由T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌產(chǎn)生，并且具有很多的生物功能，它能促使粒細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)行分化和增殖并能產(chǎn)生集落。該細(xì)胞因子尤其促進(jìn)樹突細(xì)胞的前體細(xì)胞的分化，并促使樹突狀細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞集中到抗原注射的部位。因此，GM-CSF作為新一代的高效分子免疫佐劑具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。本試驗(yàn)將豬GM-CSF(pG

2、M-CSF)基因在干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)，然后將pGM-CSF與豬偽狂犬病活疫苗聯(lián)合使用，分析評(píng)價(jià)其對(duì)疫苗免疫效果的影響。
　　 本研究通過合成pGM-CSF基因，并設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到去除信號(hào)肽的pGM-CSF基因，基因全長為396bp，以pET30b作為表達(dá)載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET30b-pGM-CSF，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pGM-CSF蛋白，經(jīng)SDS-PAGE與Western blot分析，表達(dá)蛋白

3、大小約23ku，主要以包涵體形式存在。為獲得可溶性表達(dá)，將質(zhì)粒pET30b-pGM-CSF與分子伴侶pG-KJE8共同轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，利用Ni-NTA對(duì)可溶性蛋白進(jìn)行純化。通過外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖試驗(yàn)、單核細(xì)胞增殖試驗(yàn)和集落形成試驗(yàn)，分析其生物活性，結(jié)果顯示，pGM-CSF蛋白對(duì)PBMC和單核細(xì)胞具有明顯的刺激其增殖的生物功能。
　　 將pGM-CSF基因定向插入到乳酸桿菌

4、表達(dá)載體pPG-2中，構(gòu)建了分泌表達(dá)型重組乳酸菌載體pPG-2-pGM-CSF/L.casei393。經(jīng)1％乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)的上清蛋白能與豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子單抗特異性結(jié)合，表明成功獲得了目的蛋白的分泌表達(dá)。通過對(duì)促PBMC和單核細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性檢測，結(jié)果顯示，干酪乳桿菌表達(dá)的pGM-CSF具有良好的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)PBMC和單核細(xì)胞的體外增殖。為進(jìn)一步研究pGM-CSF的免疫佐劑作

5、用，將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，濃縮培養(yǎng)上清，以四種不同濃度（100μg、50μg、25μg、12μg）與豬偽狂犬病活疫苗聯(lián)合免疫小鼠，同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組、單獨(dú)疫苗組和疫苗與pPG-2/L.casei393聯(lián)合免疫組。分別在注射疫苗前3d和注射疫苗后3d在同一注射部位注射pGM-CSF;并于免疫前和免疫后第4d、7d、10d、14d采集小鼠血清，利用間接ELISA方法檢測免疫后特異性抗體水平，結(jié)果表明，疫苗與pGM-CSF聯(lián)合免疫組抗體水平均高

6、于單獨(dú)疫苗組。在不同濃度pGM-CSF的聯(lián)合免疫組中，50μg組抗體水平要明顯高于其他三組，且與單獨(dú)疫苗組相比差異極顯著(p＜0.01)，25μg組與單獨(dú)疫苗組相比差異顯著(p＜0.05)。同時(shí)通過細(xì)胞中和試驗(yàn)檢測抗體的中和效價(jià)，單獨(dú)疫苗組血清抗體中和豬偽狂犬病毒效價(jià)為1∶44.36，疫苗與pPG-2/L.casei393聯(lián)合免疫組抗體中和效價(jià)為1∶46.3，疫苗與pGM-CSF聯(lián)合免疫組的抗體中和效價(jià)為1∶62.5。使用MTT法檢測免

7、疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，在低濃度（1μg/mL）和中濃度（5μg/mL）抗原的刺激下，疫苗與pGM-CSF聯(lián)合免疫組的脾淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)較單獨(dú)疫苗組、疫苗pPG-2/L.casei393聯(lián)合免疫組差異極顯著(p＜0.01)。表明疫苗與pGM-CSF聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了更高的特異性免疫應(yīng)答水平。在免疫后14d，進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，觀察不同組小鼠發(fā)病和死亡情況，結(jié)果可知，單獨(dú)疫苗組、疫苗與pPG-2/L.casei393聯(lián)

8、合免疫組攻毒保護(hù)率達(dá)33％，疫苗與pGM-CSF聯(lián)合免疫組攻毒保護(hù)率可達(dá)50％。以上結(jié)果證明豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子具有較好的免疫佐劑效應(yīng)，有效地增強(qiáng)了特異性免疫應(yīng)答的水平，并在一定程度上提高了對(duì)病毒感染的保護(hù)效力。
　　 綜上所述，本研究所獲得的結(jié)果表明，通過于酪乳桿菌分泌表達(dá)了pGM-CSF蛋白，經(jīng)檢測具有良好的生物活性，與疫苗聯(lián)合使用時(shí)具有良好的佐劑特性，為pGM-CSF的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，并為其他疫苗佐