苦瓜葉片胞間抗菌蛋白的分離純化研究.pdf

1、抗菌蛋白是一類由動(dòng)物、植物等為保護(hù)其自身抵抗病原菌侵染而產(chǎn)生的具有不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。目前人們對抗菌蛋白的研究越來越深入，已從不同的生物體內(nèi)分離得到了上百種抗菌蛋白或多肽，并對某些抗菌蛋白的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理等研究的比較清楚。
　　 本研究以苦瓜葉片為材料，用真空抽提法提取苦瓜葉片胞間液，將該提取液進(jìn)行硫酸銨沉淀處理后得到的蛋白粗提液進(jìn)行一系列的色譜分離過程，最后純化得到的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果顯示該蛋白已達(dá)到電泳純，將其定名

2、為Chit-Pr。進(jìn)一步將該蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用Edman降解法測定其N-端氨基酸序列，并進(jìn)行序列比對；同時(shí)研究了Chit-Pr對植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用。在分離純化苦瓜葉片胞間抗菌蛋白的過程中，我們還從分離自煙草莖上的芽孢桿菌中純化得到了一個(gè)新的抗菌蛋白 BTL，并對該蛋白進(jìn)行了抗菌活性測定。上述研究的主要結(jié)果如下：
　　 1.通過對苦瓜葉片胞間提取液進(jìn)行硫酸銨沉淀、Bio-Gel P-6柱(1.6×30

3、 cm)脫鹽、HiPrepTM16/10 CM FF陽離子交換層析、HiLoadTM16/60 Superdex30凝膠過濾和SOURCE5RPC反相HPLC純化，最終獲得一個(gè)電泳純的抗真菌蛋白，定名為Chit-Pr。
　　 2.純化的苦瓜葉片胞間抗菌蛋白Chit-Pr通過SDS-PAGE測得其分子量約為25000 Da；進(jìn)一步將該蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用Edman降解法測得其N-端氨基酸序列為：NH2-VEYTITGNAG

4、NTPGG。序列分析結(jié)果顯示：該抗菌蛋白與來自顛茄中的病程相關(guān)蛋白具有較高的同源性，推測該抗菌蛋白為病程相關(guān)蛋白。
　　 3.苦瓜葉片胞間抗菌蛋白Chit-Pr對植物病原真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用結(jié)果顯示：Chit-Pr蛋白對黑曲霉(Aspergillus niger)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Vasinfectum)、花生黑斑病菌(Cercospora personata)、煙草赤星

5、病菌(Alternaria alternata)、白菜黑斑病菌(Altenaria brassicae)、鐮刀菌(Fusarium spp.)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、毛霉(Mucor sp.)的菌絲生長具有抑制作用；對花生黑斑病菌(Cercospora personata)、白菜黑斑病菌(Altenaria brassicae)的孢子萌發(fā)有較明顯的抑制作用。
　　 4.芽孢桿菌抗菌蛋白BTL的分離

6、純化與抗菌活性檢測。通過離子交換和 SOURCE5RPC反相HPLC色譜，從芽孢桿菌中分離純化得到一抗菌肽 BTL，TOF-MS測得其分子量為2237.690 Da，Edman降解法測得其N-端氨基酸序列為：NH2-KQQLATEAESAGPIL。該抗菌肽的平板抑菌結(jié)果顯示 BTL對玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、花生黑斑病菌(Cercospora personata)、白