曲霉菌胞壁及胞外多糖的分離和純化.pdf

1、目的：
　　半乳甘露聚糖(galactomannan,簡稱GM)存在于曲霉菌胞壁，且在曲霉菌生長過程中會釋放至外液。GM已作為診斷侵襲性曲霉菌感染的標(biāo)志物，而現(xiàn)有的檢測方法存在諸多局限性，本研究目的從煙曲霉菌中提取純度高、分子量均一的GM，為進一步建立基于GM檢測的侵襲性曲霉菌感染診斷新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.選取溫度為A因素、通氣量為B因素、接種量為C因素，各取3個水平，以菌體生成量和胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)進

2、行正交實驗，通過分析選取最優(yōu)培養(yǎng)條件。
　　2.收集煙曲霉發(fā)酵液，通過濃縮、醇沉、抽濾、透析、凍干等步驟得到粗多糖，再將粗多糖行去蛋白、過柱等純化步驟處理，得到多糖P1；采用堿裂解菌絲體，經(jīng)過離心、濃縮、透析、凍干等步驟得到粗多糖，經(jīng)conA sepharose4B親和層析填料純化，加入葡聚糖酶，得到多糖P2。
　　3.采用TOSOH TSK gel3000PWxl柱子，分析多糖的純度；高效凝膠色譜法測定標(biāo)準品右旋糖酐分子量

3、，并制成標(biāo)準曲線，計算出待測多糖分子量。
　　4.用三氟乙酸催化多糖水解成單糖，采用硅膠薄層層析法初步分析多糖的單糖組分；繼而用三甲基硅咪唑和醋酸酐將單糖衍生化，使之成為易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的衍生物，采用氣相色譜法進一步分析單糖的種類和比例。
　　結(jié)果：
　　1.通過正交試驗分析，培養(yǎng)溫度28℃、通氣量150ml，接種量為5％時，曲霉菌的生長狀態(tài)最好，得到的胞外多糖量和菌絲體量分別為初始條件的1.151倍和1.273倍。<

4、br>　　2.經(jīng)過一系列純化步驟，得到1.58g的胞外多糖P1，純度達94.7%；162.7mg胞內(nèi)多糖P2，純度為96.0%；高效凝膠色譜法分析，胞外多糖分子量均一，分子量在21kd左右，而胞內(nèi)多糖的分子量不均一。
　　3.硅膠薄層色譜法初步分析，P1、P2多糖的單糖組分均為半乳糖和甘露糖。通過氣相色譜分析，P1的半乳糖與甘露糖的比例為1:1.18。
　　結(jié)論：
　　本實驗成功地從煙曲霉菌的胞外發(fā)酵液中分離到純度高、