槲寄生糖蛋白的分離純化研究.pdf

1、槲寄生又名北寄生、柳寄生、寄生子，為桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常綠小灌木。常寄生于桑科、茶科、山毛莫科、蕓香料、薔薇科和豆科等29科50余種植物上。該屬植物有36個(gè)種，我國(guó)分布11個(gè)種，在我國(guó)大部分省區(qū)都有分布，主產(chǎn)于河北、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古等省區(qū)內(nèi)。槲寄生作為傳統(tǒng)中藥有著悠久的歷史，我國(guó)傳統(tǒng)上將它作為祛風(fēng)濕藥物，其味苦、平，歸肝、腎經(jīng)，有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎作用，一般以干燥的帶葉莖枝入藥。在歐洲，含有槲寄生毒素

2、、凝集素等糖蛋白的制劑長(zhǎng)期以來(lái)被用作癌癥治療的輔助藥物，如Iscador，Helixor和Plenoso等。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)槲寄生的研究發(fā)展較快，不斷發(fā)現(xiàn)新療效和新應(yīng)用，槲寄生抗腫瘤活性物質(zhì)主要有槲寄生生物堿、槲寄生蛋白和槲寄生多糖等，其中的槲寄生蛋白以其種類多和抗腫瘤活性強(qiáng)而越來(lái)越受到廣大研究者的關(guān)注。
　　 本文對(duì)槲寄生糖蛋白的分離純化進(jìn)行了初步研究，期望能從槲寄生藥材中得到具有抗腫瘤活性的蛋白。主要內(nèi)容包括槲寄生浸提液的組成

3、對(duì)槲寄生浸提率的影響實(shí)驗(yàn)，并對(duì)槲寄生蛋白的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化；各種脫色介質(zhì)對(duì)槲寄生蛋白粗品復(fù)溶液脫色的實(shí)驗(yàn)研究，并找出較好的脫色工藝路線；脫色后槲寄生蛋白溶液分離純化條件的實(shí)驗(yàn)研究；分離純化所得蛋白的理化性質(zhì)的初步研究。
　　 首先本文在確定了浸提液種類、浸提溫度、鹽析硫酸銨飽和度后，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)研究了浸提時(shí)間、料液體積比及浸提次數(shù)對(duì)槲寄生浸提率的影響。確定槲寄生蛋白的最優(yōu)提取工藝為：浸提液為含0.1 mol/L乳糖的0.01 m

4、ol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.30)，槲寄生浸提液鹽析時(shí)硫酸銨飽和度為70％，浸提溫度為4℃，浸提時(shí)間為36h，料液體積比為6，浸提2次。槲寄生蛋白收率為0.189％。
　　 其后，對(duì)槲寄生蛋白粗品復(fù)溶液進(jìn)行了脫色工藝研究。重點(diǎn)考察了D707樹脂和顆粒活性炭柱層析的脫色工藝條件。以脫色率、蛋白損失率和經(jīng)濟(jì)效益為考察指標(biāo)，確定顆?；钚蕴康拿撋に嚄l件為最優(yōu)，其脫色工藝條件為：槲寄生蛋白復(fù)溶液粗品脫色時(shí)的最佳pH值為4.

5、50，活性炭最佳用量為10 g活性炭/50 mL槲寄生粗蛋白復(fù)溶液，樣品吸附流速為0.6 mL/min，洗脫液為0.5 mol/L硫酸銨(pH8.50)。槲寄生蛋白粗品復(fù)溶液在脫色前不需透析，可直接上樣進(jìn)行脫色。
　　 最后采用DEAE-纖維素離子交換樹脂對(duì)脫色后槲寄生蛋白進(jìn)行分離純化研究?？疾炝松蠘恿魉?、洗脫液、樣品pH值等工藝條件。確定分離純化工藝條件為：離子交換層析中平衡液和樣品溶解均選用0.01 mol/L的Tris-H

6、Cl(pH7.50)緩沖液，洗脫液為1.0 mol/L NaCl(pH8.50)Tris-HCl緩沖液，洗脫流速與上樣流速均為0.5 mL/min。分離得到兩種蛋白HJS1和HJS2。HJS1和HJS2的產(chǎn)率分別為0.62‰和0.41‰。
　　 本論文還對(duì)HJS1和HJS2作了簡(jiǎn)單的理化性質(zhì)研究。實(shí)驗(yàn)表明HJS1和HJS2已達(dá)電泳純，分子量分別約為60 kDa和130 kDa。按硫酸-苯酚法測(cè)得HJS1的分子中含有約1.59％的