大米蛋白提取與分離純化技術(shù)的研究.pdf

1、我國(guó)是世界上稻米資源最豐富的國(guó)家,年產(chǎn)量達(dá)2億t左右,稻谷加工中占總量10%～30%的副產(chǎn)品碎米主要用于生產(chǎn)淀粉糖、味精及釀酒等,生產(chǎn)淀粉糖的副產(chǎn)品米渣的利用一直是困擾企業(yè)的一個(gè)難題,過(guò)去一直未能充分合理利用,大多將其充作動(dòng)物飼料,造成了寶貴蛋白資源的巨大浪費(fèi)。米渣中蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上,是提取大米蛋白的極好原料,將大米中的蛋白質(zhì)合理回收利用,不僅可為人類帶來(lái)豐富的蛋白資源,消除大米蛋白給傳統(tǒng)淀粉及淀粉糖漿生產(chǎn)帶來(lái)的不利影響;而且還

2、可提高稻米加工水平及副產(chǎn)品附加值,具有重要的社會(huì)效益和較高的經(jīng)濟(jì)效益。
　　 大米蛋白是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)食用蛋白,其生物效價(jià)高,屬于低抗原性蛋白,不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),在所有谷物中大米是唯一可免于過(guò)敏試驗(yàn)的谷物品種,因而大米蛋白被認(rèn)為是一種具有高開(kāi)發(fā)價(jià)值的植物蛋白資源,受到了全世界研究者們的關(guān)注。深入了解其分子組成、結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)是合理開(kāi)發(fā)和利用大米蛋白的第一步,大米蛋白的結(jié)構(gòu)分析和功能評(píng)價(jià)需要獲取高純度大米蛋白;同時(shí),大米蛋白的高疏水性也

3、使之不能廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域,因而需要通過(guò)改性來(lái)提高其功能特性,但目前還未見(jiàn)對(duì)已知結(jié)構(gòu)的大米蛋白進(jìn)行改性研究的報(bào)道。因此,對(duì)大米蛋白進(jìn)行分離純化已成為深入研究大米蛋白構(gòu)效關(guān)系和改性機(jī)理的非常必要的前提條件。
　　 論文以秈米為原料,首先對(duì)大米蛋白的組成特點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)研究,采用Osborne分級(jí)分離蛋白的經(jīng)典方法對(duì)大米中的4種蛋白組分清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白進(jìn)行了順序提取,結(jié)果表明谷蛋白含量最高(84.09%),其次是球蛋白

4、(9.38%)、醇溶蛋白(3.49%)和清蛋白(3.04%)。采用SDS-PAGE對(duì)四種蛋白組分進(jìn)行分析,研究結(jié)果表明:清蛋白的分子量分布為:59.8kDa,42.4kDa,16.2kDa;球蛋白電泳帶中對(duì)應(yīng)相對(duì)分子量分別為55.2～53.8kDa,25.9～23.4kDa,20.2～17.9kDa,16.5kDa:醇溶蛋白主要有一組相對(duì)分子質(zhì)量為16.8～14.5kDa,左右的譜帶。按照分子量分布范圍可以將谷蛋白明顯劃分為6個(gè)區(qū)域:5

5、4.6kDa,38.4～37.1kDa,36.3～34.2kDa,25.9～24.1kDa,22.2～21.4kDa,16.3～14.9kDa,谷蛋白組成相對(duì)復(fù)雜。
　　 根據(jù)大米中4種蛋白組分的分布特點(diǎn),確定將堿提酸沉法制備的大米谷蛋白作為后續(xù)研究對(duì)象,在本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上擬定堿法提取大米蛋白(riceprotein)的條件為:原料大米經(jīng)粉碎過(guò)120目篩,堿液濃度0.05mol/L,料液比1:10,常溫提取2h。此條件下可

6、提取73.89%的大米蛋白,所制備的大米蛋白其蛋白含量為87.90%,在pH5～8范圍內(nèi)溶解度不足5%,pH接近11時(shí),大米蛋白的溶解度迅速提高,pH12.5時(shí)其溶解度達(dá)85.17%。通過(guò)高效液相色譜(HPLC)分析不同溶解體系中大米谷蛋白溶液相對(duì)分子質(zhì)量分布發(fā)現(xiàn),在各種溶劑中大米蛋白均未完全溶解,溶出部分之間產(chǎn)生差異,改變?nèi)芤簆H(pH<3,pH>10)或加入SDS等提高蛋白溶解度的方法均有利于高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)的溶出。
　　

7、 為了將本實(shí)驗(yàn)室的前期研究成果有效提升至產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)水平,本研究在前期研究基礎(chǔ)之上建立了一條中試生產(chǎn)線,采用堿提酸沉法生產(chǎn)出了符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的大米蛋白,完成了大米蛋白提取工藝的中試放大。目前已經(jīng)能夠穩(wěn)定生產(chǎn)出蛋白含量在85%以上的大米蛋白粉,達(dá)到了中試試驗(yàn)的預(yù)期要求。
　　 堿提酸沉法初步分離得到的大米谷蛋白系混合物,大米蛋白的結(jié)構(gòu)分析和功能評(píng)價(jià)都需要獲取高純度大米蛋白,因此需進(jìn)一步對(duì)大米蛋白進(jìn)行分離純化。分析本實(shí)驗(yàn)室自制大米蛋白

8、的溶解度發(fā)現(xiàn),在pH3～10范圍內(nèi),大米谷蛋白的溶解度均在10%以下,其低溶解度成為了對(duì)其進(jìn)行分離純化的困難所在。本研究采用離子交換和凝膠層析探索了堿提酸沉法制備的大米谷蛋白的分離純化方法。以0.05mol/LNa2HPO4-NaOH(pH12.50)緩沖液溶解堿提大米谷蛋白,利用DEAESepharoseFastFlow離子交換層析介質(zhì)對(duì)堿提大米谷蛋白進(jìn)行了初步分離純化,依次用0.10mol/L、0.25mol/L、0.40mol/L

9、、0.55mol/L的含鹽緩沖液階段洗脫堿提大米谷蛋白,分離得到三個(gè)洗脫峰F1、F2、F3,采用HPLC對(duì)F3組分進(jìn)行純度分析,其純度為73.63%,在Na2HPO4-NaOH緩沖體系中,堿提大米谷蛋白溶解較為完全,利用不同濃度鹽溶液將堿提大米谷蛋白按所帶電荷強(qiáng)度從小到大進(jìn)行初步分離純化是切實(shí)可行的。收集F3采用凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化,得到:F3-a、F3-b、F3-c、F3-d四個(gè)洗脫峰,經(jīng)HPLC檢測(cè),其中F3-d洗脫峰的分子量為3