幽門螺桿菌ureB基因在乳球菌中食品級表達及免疫反應性.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃炎、胃癌和消化道潰瘍的重要病因。目前臨床主要用抗生素和抑酸劑聯(lián)合療法,雖然取得了一定療效,但抗生素經(jīng)濟負擔高、耐藥株出現(xiàn)和藥物的副作用等使得抗生素治療受限。在此情況下,疫苗就成了最有效的方法,具有很好的應用前景。
　　 尿素酶(Urease,Ure)是H.pylori的主要致病因子,UreB亞基已經(jīng)通過基因工程在大腸桿菌中表達,并在粘膜免疫佐劑配合下,

2、能引起免疫應答。所有的經(jīng)口免疫模型必須用霍亂毒素(Cholera toxin,CT)或大腸桿菌不耐熱腸毒素(E.coli labile toxin,LT)作為免疫佐劑。但是CT和LT都有一定的毒性而不能用于人體,加上目前疫苗大多采用鼠傷寒減毒沙門氏菌為抗原提呈載體,對免疫力低下的人群危害大,限制了疫苗的使用。
　　 但用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)做為活菌疫苗的宿主菌,就可以避免上述危害。

3、但傳統(tǒng)的基因改良菌往往以抗生素抗性基因作為篩選標記,這就存在潛在的因生物轉(zhuǎn)基因污染而引起的抗生素耐藥的危害。因此完全的食品級表達系統(tǒng)的研發(fā)一直是該領(lǐng)域的熱點。
　　 材料與方法
　　 1.從重組質(zhì)粒pMD19-T-ureB雙酶切得到ureB基因；雙酶切膠回收乳酸菌載體pNZ8149(該載體以lacF基因為篩選標記),連接后電轉(zhuǎn)化入lacF基因缺失的乳酸乳球菌NZ3900。挑陽性克隆進行酶切、PCR和測序鑒定。
　　

4、 2.用正交試驗,對影響目的蛋白誘導產(chǎn)量的因素,如誘導劑濃度、誘導時機和誘導持續(xù)時間進行實驗,用Brandford法測定目的蛋白濃度,通過方差分析得出最適宜表達條件。
　　 3.純化重組大腸桿菌TB1/pMAL-C2X-UreB的誘導產(chǎn)物MBP-UreB,混合弗氏免疫佐劑免疫小鼠,制備抗UreB免疫血清。用Western-blot免疫印跡法研究重組乳球菌NZ3900/pNZ8149-ureB表達的UreB蛋白的免疫反應性。

5、r>　　 結(jié)果：
　　 1.PCR擴增、酶切鑒定,食品級表達載體pNZ8149-ureB構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化得到重組工程菌NZ3900/pNZ8149-ureB。重組菌用乳聯(lián)菌肽(Nisin)誘導后,SDS-PAGE電泳可見64.1KD的目的蛋白UreB。
　　 2.正交實驗表明,各因素對實驗結(jié)果影響大小次序是:誘導時機、誘導劑濃度、誘導時間,只有誘導時機對實驗結(jié)果的影響有統(tǒng)計學意義；表達條件的最優(yōu)組合:在菌體培養(yǎng)到OD60

6、0為0.4時加入終濃度為25ng/mL的Nisin,誘導表達5h。
　　 3.制備的小鼠抗UreB血清,經(jīng)ELISA鑒定效價為1:800。將乳酸菌誘導表達的目的蛋白UreB轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用制備的小鼠血清進行Western blot分析,可在相應位置顯示雜交條帶,說明乳酸菌誘導表達的UreB具有良好的免疫反應原性。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了表達UreB的不含任何抗生素抗性篩選標記的乳酸乳球菌食品級原