幽門螺桿菌ureB基因在乳球菌中食品級(jí)表達(dá)及免疫反應(yīng)性.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃炎、胃癌和消化道潰瘍的重要病因。目前臨床主要用抗生素和抑酸劑聯(lián)合療法,雖然取得了一定療效,但抗生素經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高、耐藥株出現(xiàn)和藥物的副作用等使得抗生素治療受限。在此情況下,疫苗就成了最有效的方法,具有很好的應(yīng)用前景。
　　 尿素酶(Urease,Ure)是H.pylori的主要致病因子,UreB亞基已經(jīng)通過基因工程在大腸桿菌中表達(dá),并在粘膜免疫佐劑配合下,

2、能引起免疫應(yīng)答。所有的經(jīng)口免疫模型必須用霍亂毒素(Cholera toxin,CT)或大腸桿菌不耐熱腸毒素(E.coli labile toxin,LT)作為免疫佐劑。但是CT和LT都有一定的毒性而不能用于人體,加上目前疫苗大多采用鼠傷寒減毒沙門氏菌為抗原提呈載體,對(duì)免疫力低下的人群危害大,限制了疫苗的使用。
　　 但用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)做為活菌疫苗的宿主菌,就可以避免上述危害。

3、但傳統(tǒng)的基因改良菌往往以抗生素抗性基因作為篩選標(biāo)記,這就存在潛在的因生物轉(zhuǎn)基因污染而引起的抗生素耐藥的危害。因此完全的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的研發(fā)一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 材料與方法
　　 1.從重組質(zhì)粒pMD19-T-ureB雙酶切得到ureB基因；雙酶切膠回收乳酸菌載體pNZ8149(該載體以lacF基因?yàn)楹Y選標(biāo)記),連接后電轉(zhuǎn)化入lacF基因缺失的乳酸乳球菌NZ3900。挑陽性克隆進(jìn)行酶切、PCR和測(cè)序鑒定。
　　

4、 2.用正交試驗(yàn),對(duì)影響目的蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)量的因素,如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),用Brandford法測(cè)定目的蛋白濃度,通過方差分析得出最適宜表達(dá)條件。
　　 3.純化重組大腸桿菌TB1/pMAL-C2X-UreB的誘導(dǎo)產(chǎn)物MBP-UreB,混合弗氏免疫佐劑免疫小鼠,制備抗UreB免疫血清。用Western-blot免疫印跡法研究重組乳球菌NZ3900/pNZ8149-ureB表達(dá)的UreB蛋白的免疫反應(yīng)性。

5、r>　　 結(jié)果：
　　 1.PCR擴(kuò)增、酶切鑒定,食品級(jí)表達(dá)載體pNZ8149-ureB構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)化得到重組工程菌NZ3900/pNZ8149-ureB。重組菌用乳聯(lián)菌肽(Nisin)誘導(dǎo)后,SDS-PAGE電泳可見64.1KD的目的蛋白UreB。
　　 2.正交實(shí)驗(yàn)表明,各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大小次序是:誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間,只有誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；表達(dá)條件的最優(yōu)組合:在菌體培養(yǎng)到OD60

6、0為0.4時(shí)加入終濃度為25ng/mL的Nisin,誘導(dǎo)表達(dá)5h。
　　 3.制備的小鼠抗UreB血清,經(jīng)ELISA鑒定效價(jià)為1:800。將乳酸菌誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白UreB轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,用制備的小鼠血清進(jìn)行Western blot分析,可在相應(yīng)位置顯示雜交條帶,說明乳酸菌誘導(dǎo)表達(dá)的UreB具有良好的免疫反應(yīng)原性。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了表達(dá)UreB的不含任何抗生素抗性篩選標(biāo)記的乳酸乳球菌食品級(jí)原