幽門(mén)螺桿菌cheA基因在細(xì)菌體外趨化和體內(nèi)定植過(guò)程中的作用.pdf

1、背景和目的：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori)是多種人胃炎和消化性潰瘍的病原體,持續(xù)感染則與胃腺癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤及原發(fā)性胃非何杰金淋巴瘤發(fā)病密切相關(guān)[1,2]。在致病過(guò)程中,病原菌必然能感知并通過(guò)定向運(yùn)動(dòng)也即趨化(chemotaxis)到達(dá)合適的寄生部位進(jìn)行定植(colonization),然后大量繁殖引起疾病[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道,在有鞭毛的病原菌中,鞭毛提供細(xì)菌動(dòng)力,但趨化運(yùn)動(dòng)受二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)(two-c

2、omponent signaling system,TCSS)調(diào)控[4-7]。TCSS通常由跨膜組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK)和胞漿反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(response regulator protein,RR)組成[8]。在幽門(mén)螺稈菌基因組中,存在趨化相關(guān)TCSS(Che-TCSS)HK編碼基因cheA及RR編碼基因cheY[8],但作為Che-TCSS的CheA/CheY在該菌體外趨化和宿主體內(nèi)定

3、植中的作用,迄今未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 我們以往研究結(jié)果證實(shí),H離子是誘導(dǎo)幽門(mén)螺桿菌趨化的信號(hào)分子,同時(shí)建立了幽門(mén)螺桿菌體外趨化模型[9]。本研究中,我們根據(jù)同源重組交換原理,采用基于自殺質(zhì)粒的基因敲除技術(shù)構(gòu)建了幽門(mén)螺桿菌NCTC11637株cheA基因敲除突變株(cheA),然后分別采用幽門(mén)螺桿菌體外趨化模型及小鼠感染模型等生物學(xué)試驗(yàn),探討了cheA基因在幽門(mén)螺桿菌趨化和定植中的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：從幽門(mén)螺桿菌NCT

4、C11637株基因組DNA中擴(kuò)增并克隆全長(zhǎng)cheA和cheY基因。構(gòu)建該兩個(gè)基因原核表達(dá)系統(tǒng),Ni-NTA親和層析法提取目的重組蛋白rCheA和rCheY。rCheA和rCheY免疫家兔制備抗血清,采用硫酸銨沉淀法及DEAE-52柱層析法制備rCheA-IgG和rCheY-IgG。構(gòu)建cheA基因自殺質(zhì)粒,根據(jù)同源重組交換原理利用該自殺質(zhì)粒構(gòu)建cheA基因敲除突變株(cheA),采用PCR及測(cè)序?qū)heA突變株進(jìn)行鑒定。采用rCheA-

5、IgG和rCheY-IgG錨定靶蛋白及蛋白磷酸化檢測(cè)試劑盒,測(cè)定cheA變株與野生株CheA和CheY分子磷酸化水平。采用幽門(mén)螺桿菌趨化模型及BALB/c小鼠感染模型,比較cheA突變株與野生株體外趨化及體內(nèi)定植能力的差異。
　　 結(jié)果：PCR及測(cè)序結(jié)果證實(shí)cheA突變株基因組中cheA基因被敲除。0.001～0.1 mol/L鹽酸作用10 min,野生株CheA和CheY磷酸化水平分別從59.6±11.5和55.5±10.2μ

6、mol迅速下降至10.8±2.6和5.5±1.2μmol(P＜0.05),cheA突變株CheY磷酸化水平均較低且無(wú)明顯變化(P＞0.05)。cheA突變株對(duì)鹽酸、硫酸和乙酸趨化聚集環(huán)直徑(10～20±2.0～3.0 mm)明顯小于野生株(16～24±2.0～3.0 mm)(P＜0.05)。野生株感染小鼠胃黏膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌分離陽(yáng)性率(90％)明顯高于cheA突變株(40％)(P＜0.05),熒光定量PCR結(jié)果也顯示野生株感染小鼠胃黏