新型功能分子BST2單克隆抗體的制備、鑒定和初步應(yīng)用.pdf

1、BST2(Bone Marrow Stromal Antigen2)骨髓基質(zhì)細(xì)胞抗原2，又被稱(chēng)為CD317，HM1.24或者 tetherin，是天然免疫中針對(duì)囊膜病毒的應(yīng)答因子。BST2的 cDNA是從由風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎衍生出的一種滑液細(xì)胞系中克隆出來(lái)，當(dāng)時(shí)被認(rèn)為BST2蛋白參與了前體B細(xì)胞生長(zhǎng)。BST2能夠?qū)pu蛋白缺失的HIV-1病毒粒子拴在細(xì)胞膜上，阻止病毒的釋放，BST2因此被命名為“tetherin”。BST2對(duì)囊膜病毒的出膜

2、具有廣譜的抑制作用，是抗擊囊膜病毒疾病的一種天生固有的免疫方式。BST2有如此廣譜的抑制病毒作用的原因之一，在于這些病毒都具有源于宿主細(xì)胞雙層脂膜的囊膜結(jié)構(gòu)，BST2能夠通過(guò)在病毒出細(xì)胞膜時(shí)直接拴住病毒而起到抑制作用，而近期研究發(fā)現(xiàn)，BST2還具有促進(jìn)某些病毒進(jìn)入細(xì)胞的功能。隨著對(duì) BST2功能和結(jié)構(gòu)的不斷了解，必將在相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)及疾病控制中發(fā)揮更大的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)手段，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)，根據(jù)已知的 BST2基因序列

3、設(shè)計(jì)出特異性引物，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增得到 BST2的基因片段，經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳及測(cè)序證明我們正確擴(kuò)增到BST2339bp的基因片段。設(shè)計(jì)了擴(kuò)增質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒，將 BST2基因片段克隆至質(zhì)粒中，質(zhì)粒鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至 BL21a大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，可溶性表達(dá)了 BST2的蛋白。鎳離子親和層與凝膠層析純化蛋白后，測(cè)定了蛋白濃度，使抗原達(dá)到免疫實(shí)驗(yàn)要求。三次免疫 Balb/C小鼠，加強(qiáng)免疫后采小鼠脾細(xì)胞與復(fù)蘇的SP2/0細(xì)胞株進(jìn)行融合。經(jīng)過(guò)三個(gè)

4、克隆階段，成功制備了2株鼠源單克隆抗體(McAb)，命名為10-1和11-1。經(jīng)測(cè)定效價(jià)均為107，Westernblot方法及表面等離子共振技術(shù)對(duì)其特異性及親和力等特性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示這兩株單抗具有較好的特異性和較高的親和力。采集并分離了HIV感染病人及正常人的外周血，并分離得到了外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，利用單克隆抗體及綠色熒光 FITC標(biāo)記的二抗共染了外周血單核細(xì)胞，比較了 BST2蛋白在 HIV感染病人