SiRNA沉默抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞Beclin1依賴途徑的細(xì)胞自噬的探討.pdf

1、目的:Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡（凋亡，apoptosis）和Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡（自噬，autophagy）在調(diào)節(jié)機(jī)體環(huán)境穩(wěn)態(tài)、疾病發(fā)展和清除惡性腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要的生理和病理作用。自噬和凋亡在腫瘤中均可發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存或死亡的雙重作用，二者同為程序性細(xì)胞死亡之間存在十分復(fù)雜的聯(lián)系。凋亡分子機(jī)制的研究已相當(dāng)成熟，Bcl-2蛋白家族在凋亡過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，然而自噬的分子機(jī)制尚不清楚。最近研究結(jié)果顯示，作為自噬最重要的效應(yīng)分子和腫瘤抑制

2、因子Beclin1最初作為抗凋亡蛋白Bcl-2的交互蛋白而被分離出來，Beclin1通過其BH3(Bcl-2-homology-3(BH3)amphipathicalpha-helix)結(jié)構(gòu)域與抗凋亡蛋白Bcl-2上的BH3受體(BH3receptor)結(jié)合，而抗凋亡蛋白Bcl-2在細(xì)胞自噬中的作用有待進(jìn)一步研究。研究表明，在亞洲和世界范圍內(nèi)胃癌死亡率居于人類癌癥死亡率的第二位，居于中國癌癥死亡率的首位。而人胃癌SGC-7901細(xì)胞過表

3、達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2，本研究旨在通過干擾RNA介導(dǎo)的基因敲除技術(shù)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)以揭示其在細(xì)胞自噬中的作用，為胃癌的臨床治療提供新方法，并為干擾RNA應(yīng)用于臨床治療提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染、RealTimeRT-PCR(realtimereversetranscriptionpolymerasechainreaction)、Western-Blot方法檢測外源性Bcl

4、-2特異性干擾RNA(Bcl-2siRNA)介導(dǎo)的抗凋亡因子Bcl-2轉(zhuǎn)錄后的基因沉默效應(yīng)。
　　 2應(yīng)用RealTimeRT-PCR、Western-Blot方法檢測Bcl-2siRNA轉(zhuǎn)錄SGC-7901細(xì)胞前后自噬效應(yīng)分子Beclin1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化，并分析其與抗凋亡因子Bcl-2之間的關(guān)系。
　　 3轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性siRNA后，提取基因組DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的降解情況，

5、看其細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。
　　 4用透射電子顯微鏡(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)對比觀察轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性干擾RNA(Bcl-2siRNA)組和對照siRNA(controlsiRNA)組自噬小體的變化，判斷其細(xì)胞是否發(fā)生自噬。
　　 結(jié)果:
　　 1Western-Blot結(jié)果顯示，在Bcl-2過表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性siRNA(1，2，3)

6、后，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，其蛋白下降量分別為54％、63％、82％。RealTimeRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性siRNA-3(Bcl-2siRNA-3)后，Bcl-2的mRNA表達(dá)量顯著下降，其抑制率為98％。
　　 2Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)沉默抗凋亡基因Bcl-2后，RealTimeRT-PCR和Western-Blot結(jié)果均表明自噬特異性效應(yīng)物Beclin1在mRNA和蛋

7、白表達(dá)水平均顯著增加，分別為70％，58％。
　　 3基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA-3)后，發(fā)生非凋亡性的細(xì)胞死亡。
　　 4透射電子顯微鏡對比觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA-3)組而非對照siRNA(controlsiRNA)組細(xì)胞中形成大量雙層膜包裹未被完全降解的細(xì)胞內(nèi)容物的自噬小體。
　　 結(jié)論:
　　 1B

8、cl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)可有效發(fā)揮抗凋亡基因Bcl-2轉(zhuǎn)錄后的基因沉默(PTGs，post-transcriptionalgenesilencing)作用。
　　 2抗凋亡蛋白Bcl-2應(yīng)用特異性siRNA沉默其表達(dá)后，可誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞Beclin1依賴途徑的細(xì)胞自噬。
　　 3Bcl-2特異性siRNA(Bcl-2siRNA)轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，發(fā)生的細(xì)胞死亡是自噬