骨橋蛋白調(diào)節(jié)樹突狀細胞對乙肝病毒的反應(yīng).pdf

1、研究背景及目的
　　 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染目前仍是嚴重影響中國乃至世界人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。但目前發(fā)病機制不明。
　　 病毒性肝炎的發(fā)生、發(fā)展過程中均與免疫細胞的活化及細胞因子的產(chǎn)生有密切的關(guān)系。樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)在乙型肝炎病毒的識別及抗原呈遞過程中起重要作用，影響病毒性肝炎病理生理過程中Th1、Th2的活化。研究發(fā)現(xiàn)DC既可誘導(dǎo)對肝炎病毒的

2、免疫，又可誘導(dǎo)免疫耐受，取決于DC的活化狀態(tài)。并有研究發(fā)現(xiàn)在HBV病毒未清除患者中DC的功能受損，并在抗病毒治療后，病毒清除過程中DC的功能得到一定的恢復(fù)，同時伴隨著T細胞功能的恢復(fù)。
　　 骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種分泌性磷酸化糖蛋白，作為免疫調(diào)節(jié)因子，在DC的分化，成熟、存活方面發(fā)揮重要作用。本實驗室之前的研究證明OPN在多種肝臟疾病中大量表達，與肝炎、肝癌、肝臟纖維化的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。

3、　　 本實驗?zāi)康脑谟诮沂驹谝腋尾《靖腥具^程中骨橋蛋白對樹突狀細胞的成熟以及分泌功能的影響，進而研究乙型肝炎中骨橋蛋白對樹突狀細胞作用的調(diào)節(jié)作用。
　　 材料及方法
　　 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓細胞進行培養(yǎng)，并給與IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)向DC方向的分化。于第六天分別給予刺激：LPS，HepG2.2.15培養(yǎng)上清，HepG2培養(yǎng)上清，HBcAg，HBsAg，以及空白對照，共十二組。于48h后收集細胞及培

4、養(yǎng)上清。通過流式細胞儀檢測DC表面CD分子的表達，通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。
　　 分別取野生鼠與骨橋蛋白基因敲除小鼠脾臟單個核細胞，并通過磁珠分選獲得CD4+T細胞，野生鼠來源DC或骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC分別與野生鼠來源或骨橋蛋白基因敲除小鼠來源CD4+T細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)上清。通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。
　　 收集健康成人抗凝血分離PBMC并進行培養(yǎng)，使用骨橋蛋白中

5、和性抗體阻斷骨橋蛋白作用。分別給予刺激LPS，HBcAg，HBsAg，于培養(yǎng)24h后收集細胞和上清。通過流式細胞儀檢測DC表面CD分子的表達，通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子水平。
　　 結(jié)果
　　 野生型小鼠來源DC與骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC，在無抗原刺激情況下表面CD80,CD86，MHC-Ⅱ分子表達無明顯差異，在接受HepG2.2.15培養(yǎng)上清或HBsAg刺激后，骨橋蛋白基因敲除小鼠骨髓來源DC表達CD80

6、,CD86，MHC-Ⅱ分子明顯下降，其成熟受到抑制。但HBcAg刺激則使骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC的CD80,CD86，MHC-Ⅱ分子表達有所升高。
　　 通過對DC分泌IFN-a，IL-12的分析，發(fā)現(xiàn)在無抗原刺激時骨橋蛋白缺陷的DC與野生鼠來源DC相比IFN-a分泌水平降低，在HBV抗原刺激后仍低于野生鼠來源的DC的分泌水平，IL-12的表達類似。還發(fā)現(xiàn)，雖然在HBcAg抗原刺激后骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC表面CD分子表

7、達升高，但其分泌功能是下降的。
　　 通過對不同來源DC與相同來源CD4+T的共培養(yǎng)并檢測Th1細胞因子以及Th2細胞因子，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白基因敲除小鼠來源DC的共培養(yǎng)與野生鼠來源DC的共培養(yǎng)相比，培養(yǎng)上清中Th1細胞因子TNF-a分泌減少，而Th2細胞因子IL-4，IL-6，IL-10的產(chǎn)生水平升高。
　　 同時通過對相同來源DC與不同來源CD4+T的共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)來源相同的DC和來源不同的CD4+T共培養(yǎng)對此實驗中產(chǎn)生細胞因

8、子無明顯影響，更進一步證明在DC誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)過程中DC是否產(chǎn)生骨橋蛋白對細胞因子的產(chǎn)生起決定的作用。
　　 通過人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體封閉骨橋蛋白功能，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白抗體使DC表面CD80,CD86的水平降低，在HBV抗原刺激后保持同樣的趨勢，說明骨橋蛋白功能被阻斷后，DC的成熟受到抑制。
　　 通過人PBMC培養(yǎng)并給予骨橋蛋白中和性抗體來封閉骨橋蛋白功能，發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白功能被阻斷后可導(dǎo)致DC分泌IL-1

9、2功能下降，同時Th1型細胞因子IFN-a分泌降低，而Th2型細胞因子分泌水平升高。
　　 結(jié)論
　　 1.DC在發(fā)育和成熟過程中能夠分泌大量骨橋蛋白，并且骨橋蛋白在DC發(fā)育以及成熟過程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.骨橋蛋白的缺乏或不足抑制HBV抗原刺激后DC表面CD80,CD86分子的表達，使DC的成熟受抑制。
　　 3.骨橋蛋白的缺乏或不足導(dǎo)致HBV抗原刺激后DC分泌細胞因子水平下降，分泌功能受影響。<