小鼠B7-DC基因沉默對(duì)樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的抗乙肝病毒免疫的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒是一種非細(xì)胞裂解性病毒,它是引起急、慢性肝炎的主要病原。研究發(fā)現(xiàn),在慢性乙肝患者體內(nèi)的CD8+ T細(xì)胞的增殖和效應(yīng)能力很弱,提示了增強(qiáng)病毒特異性T細(xì)胞的反應(yīng)能力可能是控制慢性乙肝病毒持續(xù)感染的一條途徑。目前,樹突狀細(xì)胞疫苗被公認(rèn)為是抗腫瘤和抗慢性病毒感染的有效方法之一。
　　因此,基于樹突狀細(xì)胞的治療性疫苗對(duì)于乙肝的免疫治療是可行的。許多研究表明,B7家族提供的共刺激信號(hào)對(duì)促進(jìn)和抑制T細(xì)胞活化具有至關(guān)重要的作用。B7-

2、DC是B7家族的第五個(gè)成員,被認(rèn)為是PD-1的第二個(gè)配體,可以負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化。B7-DC選擇性表達(dá)于樹突狀細(xì)胞上,因此,如果阻斷樹突狀細(xì)胞與T細(xì)胞B7-DC/PD-1間的相互作用,有可能使樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)更強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)。RNA干擾是一種新穎的基因調(diào)節(jié)機(jī)制,是通過雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),它是目前封閉基因表達(dá)行之有效的方法之一。
　　本研究中,我們從小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增B7

3、-DC胞外段,并將其克隆至原核表達(dá)載體pET32a（+）中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a（+）-B7-DCECD。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及序列測定后,轉(zhuǎn)化E.coliBL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行檢測。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,成功獲得全長為582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因,經(jīng)測序證實(shí)其序列正確。SDS-PAGE和Western blot分析證實(shí)重組質(zhì)?？杀磉_(dá)出Mr約為41

4、000的B7-DC胞外段蛋白。同時(shí)我們對(duì)攜帶有針對(duì)目標(biāo)基因的shRNA在抑制樹突狀細(xì)胞上B7-DC基因的表達(dá)水平,以及基因修飾的樹突狀細(xì)胞的功能方面作了初步的研究。成功構(gòu)建兩個(gè)siRNA真核表達(dá)載體并在體外轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞,檢測結(jié)果表明兩個(gè)siRNA真核表達(dá)載體均可抑制樹突狀細(xì)胞上B7-DC基因的表達(dá),重組干擾質(zhì)粒shRNA1-B7-DC和shRNA2-B7-DC抑制B7-DC基因的效率分別為61.4％、45.9%?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)中B7

5、-DC基因沉默的樹突狀細(xì)胞可顯著刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖。將基因修飾的樹突狀細(xì)胞免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,檢測結(jié)果表明在效:靶比為50:1時(shí),經(jīng)shRNA1-B7-DC轉(zhuǎn)染后致敏的DCs細(xì)胞免疫組小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷活性顯著高于空載體pAS轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組,提示樹突狀細(xì)胞中B7-DC基因沉默后誘導(dǎo)更強(qiáng)的CTL殺傷活性。此外,我們檢測了免疫小鼠血清中乙肝表面抗原的水平和血清中HBV DNA的濃度。
　　結(jié)果顯示,乙肝病毒特異性表位肽脈