非諾貝特對(duì)人淋巴瘤T細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)慢性炎癥性脫髓鞘疾病;其特征性病理改變是CNS白質(zhì)內(nèi)多發(fā)性脫髓鞘斑塊。確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前普遍認(rèn)為MS是主要由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)性疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)與MS在臨床表現(xiàn)和病理過(guò)程十分相似,被認(rèn)為是研究MS的發(fā)病機(jī)制和治療方法的理

2、想動(dòng)物模型。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是1991年在研究果蠅胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白。1997年Janewayt等首次在人體分離出了Toll樣受體同系物,后將其命名為T(mén)LR4。目前為止,已經(jīng)已確認(rèn)人類(lèi)11個(gè)TLRs家族成員和鼠類(lèi)13個(gè)成員,TLRs主要分布于免疫細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等,在白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等也有不同程度的表達(dá)。TLR家族成員均屬I(mǎi)類(lèi)跨膜蛋

3、白,由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。不同的TLR可相對(duì)特異地識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。其中,TLR4是主要的脂多糖(LPS)識(shí)別受體,同時(shí),脂磷壁酸、纖粘連蛋白、紫杉醇等也可作為T(mén)LR4的配體。由LPS誘導(dǎo)的TLR的活化不僅可以通過(guò)激活核因子KappaB(NF-κB)而最終誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎癥因子如TNF-α等,還可以誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟分化以及產(chǎn)

4、生各種細(xì)胞因子激活B細(xì)胞,從而對(duì)獲得性免疫的建立起著很重要的作用。
　　 過(guò)氧化體增殖物激活型受體(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是一組核激素受體,PPAR在體內(nèi)主要有3種亞型,即α,β和γ型。PPARs激動(dòng)劑具有多種生物效應(yīng),改善脂代謝紊亂,增強(qiáng)機(jī)體胰島素敏感性,影響腫瘤生長(zhǎng),對(duì)心血管產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。新近研究表明,活化的PPARs亦能發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。目前認(rèn)

5、為PPARα激動(dòng)劑對(duì)自身免疫性神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用有以下機(jī)制參與:(1)上調(diào)保護(hù)性Th2細(xì)胞比例,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。(2)減少Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生,降低其致腦脊髓炎損傷作用。(3)通過(guò)T細(xì)胞受體抑制炎性細(xì)胞的分泌增加。(4)趨化因子MCP-1等的分泌,抑制炎癥反應(yīng)。(5)維甲酸類(lèi)X受體(RXRs)與PPARpα相互作用后,形成異二聚體,上調(diào)PPAR基因表達(dá)。(6)抑制巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的NO。由此可見(jiàn),PPARα激

6、動(dòng)劑有望成為治療CNS疾病的新靶點(diǎn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PPARα激動(dòng)劑非諾貝特對(duì)脂多糖作用下人淋巴瘤T細(xì)胞TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。從而探討PPARα激動(dòng)劑非諾貝特能否通過(guò)抑制TLR4表達(dá)起到抑制炎癥擴(kuò)大的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人淋巴瘤T細(xì)胞HuT102(購(gòu)買(mǎi)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC編號(hào):GDC051)用含10%胎牛血清的

7、RPMI-1640培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各100μg/ml,2-3天更換培養(yǎng)基并傳代一次。
　　 2、脂多糖對(duì)人淋巴瘤T細(xì)胞(HuT102)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)因子的影響。
　　 (1)用RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度LPS(空白對(duì)照組、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102細(xì)胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達(dá)。
　　

8、(2)用RT-PCR方法檢測(cè)不同時(shí)間LPS(0,2h,4h,6h)刺激Hut102細(xì)胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達(dá)。
　　 (3)用ELISA方法檢測(cè)不同濃度LPS(空白對(duì)照組、0.01μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml)刺激Hut102細(xì)胞后TNF-α蛋白的表達(dá)。
　　 3、非諾貝特對(duì)脂多糖作用下人淋巴瘤T細(xì)胞(HUT102)TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路中相關(guān)因子的影響。
　　 (1)用RT

9、-PCR方法檢測(cè)不同濃度非諾貝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)對(duì)脂多糖(1μg/ml)作用下HUT102細(xì)胞TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表達(dá)。(2)用ELISA方法檢測(cè)不同濃度非諾貝特(0.1%DMSO、100μmol/L、50μmol/L)對(duì)脂多糖(1μg/ml)作用下HuT102細(xì)胞上清TNF-α蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同濃度LPS刺激Hut102細(xì)胞后TL

10、R4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達(dá)。
　　 與對(duì)照組相比,經(jīng)不同濃度LPS刺激4h后,上述目的基因mRNA表達(dá)均升高。以1μg/ml濃度組的上調(diào)作用最明顯(p＜0.01)。
　　 2、不同時(shí)間LPS刺激Hut102細(xì)胞后TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA表達(dá)。
　　 與對(duì)照組相比,經(jīng)1μg/mlLPS刺激不同時(shí)間(2、4、6h)后,上述目的基因mRNA表達(dá)均升高。以刺激6hr組的上調(diào)作用最明顯(p

11、＜0.01)。
　　 3、不同濃度LPS刺激Hut102細(xì)胞后TNF-α蛋白的表達(dá)。
　　 不加LPS刺激的對(duì)照組中TNF-α蛋白的表達(dá)量為521.47pg/ml,經(jīng)不同濃度的LPS刺激12hr后,TNF-α蛋白的表達(dá)量分別為703.87pg/ml、1028.03pg/ml、1636.08pg/ml(p＜0.01)。
　　 4、非諾貝特對(duì)LPS刺激Hut102細(xì)胞后TLR4、IRAK-1、TNF-α mRNA表達(dá)

12、的影響
　　 與0.1%DMSO對(duì)照組比較,不同濃度的非諾貝特(100μmol/L、50μmol/L)組TLR4、IRAK-1、TNF-αmRNA均下調(diào)(p＜0.01)。
　　 5、非諾貝特對(duì)LPS刺激Hut102細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)的影響
　　 與0.1%DMSO對(duì)照組比較,不同濃度的非諾貝特(100μmol/L、50μmol/L)組TNF-α蛋白下調(diào)。其中,100μmol/L非諾貝特抑制率為57.14%,5