豬氨基肽酶在MDCK細胞中的表達與鑒定.pdf

1、氨基肽酶(APN)是冠狀病毒的細胞感染受體，同屬于Ⅰ群冠狀病毒的豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、人冠狀病毒229E、貓冠狀病毒等都以相應的氨基肽酶作為其細胞感染的受體。 本研究以pMD18-T-pAPN為模版，設計了一對帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點的引物，將pAPN基因克隆出來并插入到真核表達載體pEFP-C1的BamHⅠ和HindⅢ位點之間，構建了重組質粒pEGFP-C1-pAPN。經(jīng)公司測序，所插入的pAPN基因

2、連接位點正確，并利用三維蛋白空間結構預測軟件預測分析，pAPN基因可以和GFP基因融合表達，所表達出的蛋白的空間結構相互沒有影響，與自然存在的蛋白結構相符。選用PEDV非許可性細胞犬腎細胞(Madin-Darbycaninekidney,MDCK)，通過脂質體介導的方法將重組質粒轉染至MDCK細胞中，利用載體pEFP-C1含有中新霉素磷酸轉移酶抗性基因的特性，向細胞培養(yǎng)液中添加新霉素抗性藥物G418篩選，同時運用熒光檢測手段，實時檢測G

3、FP蛋白的表達情況。經(jīng)過篩選，篩選出了幾株有G418抗性MDCK細胞系，此時，提取該MDCK細胞的總RNA，用OligdT將mRNA進行反轉錄，針對pAPN基因設計一對檢測引物進行RT-PCR反應，檢測出了3株轉染MDCK細胞有pAPN基因mRNA轉錄。用PEDV對該3株MDCK細胞系進行感染，有2株產生細胞病變，證明了pAPN在MDCK細胞中表達；同時將該MDCK細胞傳10代后，去除選擇壓力G418藥物，并續(xù)傳至20代后，PEDV感染