重組多肽Tat-HA-NR2B9C載體構(gòu)建、表達(dá)與分離純化.pdf_第1頁(yè)
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1、腦卒中是危害人類生命與健康的常見病、多發(fā)病,具有較高的致殘率和死亡率。迄今,在臨床上除早期使用溶栓藥對(duì)腦缺血有效外,尚缺乏療效明確的治療藥物。 通過(guò)對(duì)腦缺血模型的病理研究發(fā)現(xiàn),NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體過(guò)度激活導(dǎo)致腦損傷。興奮性毒性假說(shuō)認(rèn)為,NMDA受體過(guò)度激活,引起大量的Ca<'2+>內(nèi)流,是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和死亡的主要原因。因此,大量的臨床前理論研究認(rèn)為NMDA受體拮抗劑可以治療缺血性腦損傷。但是

2、,近十年來(lái)NMDA受體拮抗劑的臨床研究的結(jié)果表明,所有臨床研究使用的NMDA受體拮抗劑均因療效不確切或嚴(yán)重不良反應(yīng)而被停用。有研究者認(rèn)為,NMDA受體拮抗劑阻斷NMDA受體興奮性毒性作用的同時(shí)也阻斷了NMDA受體的正常生理功能。因此,對(duì)于突觸后信號(hào)通路的研究為阻斷NMDA受體過(guò)度激活引起的興奮性毒陛找到了新的途徑。 PSD-95(postsynaptic density-95)是一種重要的調(diào)節(jié)蛋白,它將NMDA受體信號(hào)傳遞給細(xì)胞

3、內(nèi)蛋白和酶。PSD-95通過(guò)第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域與NR2B羧基端的tSXV基序結(jié)合,同時(shí)也可以與nNOS(neuronal nitric oxide synthase)結(jié)合,激活nNOS。研究發(fā)現(xiàn)PSD-95介導(dǎo)了NMDA受體的過(guò)度激活所導(dǎo)致的NO(nitric oxide)釋放,從而引起神經(jīng)興奮毒性。本實(shí)驗(yàn)室的研究還發(fā)現(xiàn),NMDAR/PSD-95/nNOS偶聯(lián)通路對(duì)神經(jīng)元再生起抑制作用。因此阻斷該通路的信號(hào)傳導(dǎo)可能有利于減輕缺血性損傷,

4、促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)元的再生,從而改善腦缺血誘導(dǎo)的記憶功能損傷。Tat能夠攜帶有功能的NRB9C多肽片斷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并有效的干攏NMDA受體和PSD-95的結(jié)合,阻斷引起神經(jīng)毒性的下游信號(hào),但不影響神經(jīng)突觸的活性和生理狀態(tài)TCa<'2+>的內(nèi)流。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,Tat-NR289C能夠降低大鼠缺血后腦損傷的面積并能夠促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。因此,Tat-MR2B9C多肽有可能成為一種用于治療腦卒中的可行方法,同時(shí)為開發(fā)新的有臨床應(yīng)用價(jià)值的新藥提供實(shí)

5、驗(yàn)基礎(chǔ)。 本論文研究的目的是原核表達(dá)Tat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein Transduction Domain,PTD)與NR289C的融合多肽片段,并在兩片段中插入血凝素(hemagglutinin,HA)的附加抗原表位(epitope tag)。根據(jù)Tat、HA及NMDA受體羧基端9個(gè)氨基酸的氨基酸序列,在計(jì)算機(jī)輔助下設(shè)計(jì)出Tat-HA-NR289C多肽基因的全序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)出4條寡核苷酸引物片斷。以pED質(zhì)粒

6、為模版,同過(guò)三次加尾PCR將原pED質(zhì)粒的L-ansB-C基因加尾合成Ans-Tat-HA-NR289C。將該基因克隆到pET-28a的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上,并預(yù)留酸水解位點(diǎn)(aspartyl-prolyl linker),構(gòu)建表達(dá)載體pED-Tat-HA-NR289C,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)。經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后,融合蛋白表達(dá)量只有全菌體蛋白的5%左右,通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化,確定含0.1%精氨酸

7、的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí)后加入乳糖至終濃度5mM,誘導(dǎo)4小時(shí)后,融合蛋白表達(dá)量可以提高到全菌體蛋白的30%左右。該培養(yǎng)基命名為精氨酸富集培養(yǎng)基,用于提高Tat融合蛋白的表達(dá)量并且不影響菌體的生長(zhǎng)。融合蛋白的大量表達(dá)形成包涵體,包涵體在4M尿素裂解下,釋放融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C,并在2倍乙醇條件下被沉淀。在80mmol/L,HCl,50℃水解72h,融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C水解出目的多肽Ta

8、t-HA-NR289C。由于目的多肽等電點(diǎn)在10.4左右,經(jīng)陽(yáng)離子交換柱層析,在高鹽離子濃度下洗脫目的蛋白。本論文成功構(gòu)建了Tat-HA-NR289C與天冬酰胺酶C端的融合表達(dá)載體(pED-Tat-HA-NR289C),并表達(dá)純化了目的蛋白Tat-HA-NR289C。通過(guò)此過(guò)程建立了一套簡(jiǎn)單可行的融合蛋白表達(dá)、水解、分離與純化的方法。通過(guò)該方法可以獲得一定量的Tat-HA-NR289C多肽,用于研究其促進(jìn)神經(jīng)元再生(神經(jīng)元增殖、分化、存

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