合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜制備子癇前期動(dòng)物模型的研究.pdf

1、背景和目的:
　　子癇前期(pre-eclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病,發(fā)病率大約占妊娠中的3％-8%,主要表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿、凝血功能障礙等,可伴有心、腦、腎、肝等多臟器功能的損害,是產(chǎn)科常見(jiàn)的嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒健康的疾病之一。由于PE的發(fā)病機(jī)制不明,無(wú)法在PE發(fā)病的早期通過(guò)干預(yù)手段精確調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲行為來(lái)對(duì)PE進(jìn)行治療,因此,阻斷PE發(fā)病后的病理生理過(guò)程,對(duì)保障母嬰安全更有意義。子癇前期的病因研究大約已經(jīng)歷

2、半個(gè)多世紀(jì),用于發(fā)病機(jī)制研究的動(dòng)物模型各異,目前PE的動(dòng)物模型有子宮胎盤缺血缺氧、藥物誘導(dǎo)血管收縮、免疫相關(guān)、寒冷刺激、胎盤廣泛性微血栓模擬胎盤缺血缺氧狀態(tài)等,這些模型通過(guò)不同的機(jī)制在發(fā)病的不同環(huán)節(jié)復(fù)制了PE發(fā)病的病理生理過(guò)程,研究靶點(diǎn)各異,因此可應(yīng)用于不同的研究需要,但能全面模擬PE的臨床及病理生理表現(xiàn),反應(yīng)胎盤局部狀況和母體多器官功能損害的經(jīng)典模型尚欠缺。
　　PE孕婦在胎盤娩出后各種臨床癥狀迅速消失,說(shuō)明胎盤可能是誘發(fā)PE發(fā)

3、生的不良因子的來(lái)源。晚孕時(shí)胎盤與母體血液直接接觸的部分全部由合體滋養(yǎng)細(xì)胞(Syncytiotrophoblsat,ST)覆蓋,ST表面被覆微絨毛,增加與母血物質(zhì)交換的面積。隨著滋養(yǎng)細(xì)胞的激活或凋亡,其微絨毛膜會(huì)掉落到母體血循環(huán)中形成囊泡樣顆粒,稱為合體滋養(yǎng)細(xì)胞微絨毛膜(syncytiotrophoblastmicrovillousmembrane,STBM)。研究所見(jiàn)來(lái)自于胎盤的不良因子甚多,其中STBM被認(rèn)為是重要的一種,研究表明ST

4、BM在正常孕婦體內(nèi)少量存在,而在PE孕婦體內(nèi)含量上升,但其脫落的機(jī)制尚不清楚。大量的體外研究均證實(shí)STBM與PE的發(fā)病密切相關(guān),但基于這些體外研究所推測(cè)的各種發(fā)病機(jī)制在體內(nèi)是否存在尚無(wú)法證實(shí),PE發(fā)病時(shí)STBM在體內(nèi)主要的致病機(jī)制及其對(duì)主要臟器、各功能系統(tǒng)的影響尚不明確,其在正常妊娠時(shí)以及PE發(fā)病時(shí)的體內(nèi)分布、代謝特點(diǎn)、主要作用靶器官亦不明了。然而,由于倫理及孕產(chǎn)婦的特殊性,無(wú)法在人群中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),而又由于免疫等條件的限制,來(lái)源于人的ST

5、BM無(wú)法使用到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。使STBM應(yīng)用到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中受到了免疫學(xué)的限制。如能成功建立一種以STBM為研究靶點(diǎn)的PE動(dòng)物模型,就有可能觀察到STBM在體內(nèi)的致病環(huán)節(jié)及其對(duì)主要臟器、各功能系統(tǒng)的影響,有可能明確其在正常妊娠及PE發(fā)病時(shí)的體內(nèi)分布、代謝特點(diǎn)、主要作用靶器官,并闡明其在體內(nèi)致PE發(fā)病的致病環(huán)節(jié),為進(jìn)一步闡明PE的病理生理過(guò)程,發(fā)掘新的治療方法及預(yù)警指標(biāo)提供新的研究思路和直接的實(shí)驗(yàn)支持,為查找PE的致病環(huán)節(jié)提供線索,且對(duì)該領(lǐng)域后續(xù)

6、的研究具有重要的意義。
　　本研究旨在通過(guò)模擬PE發(fā)病時(shí)體內(nèi)的高濃度STBM狀態(tài),建立一種基于STBM的PE動(dòng)物模型,為進(jìn)一步闡明PE的病理生理過(guò)程,發(fā)掘新的治療方法提供直接的實(shí)驗(yàn)支持。
　　材料和方法:
　　1.研究對(duì)象及分組
　　選擇健康2月齡C57BL/6小鼠處鼠,按雌雄1:1于每日18:00合籠,于第二日清晨08:00觀察雌鼠陰道內(nèi)陰道栓,如發(fā)現(xiàn)乳白色陰道栓則視為已交配,計(jì)為妊娠第0天,隨機(jī)選擇成功受孕的

7、小鼠20只,再隨機(jī)分為兩組,標(biāo)記為STBM孕鼠組(PS組)、PBS孕鼠組(PP組),余下受孕小鼠留待制備STBM制劑時(shí)使用。另取20只2月齡C57小鼠雌鼠處鼠,隨機(jī)分為兩組,標(biāo)記為STBM處鼠組(NS組)、PBS處鼠組(NP組)。
　　2.小鼠STBM制劑的制備
　　于妊娠第18天將留待制備STBM制劑的孕鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后于無(wú)菌條件下剖宮取出胎盤,冰PBS洗去胎盤殘留血液,無(wú)菌紗布吸干表面水分后用無(wú)菌眼科剪將胎盤剪

8、為約1mm3組織塊,稱取2g胎盤組織放入100mlNaCl溶液中(0.15M,1%青-鏈霉素),4℃振蕩過(guò)夜,取上清離心:1000g,10min,棄沉淀;10000g,10min,棄沉淀;70000g,90min,棄上清,得到STBM富集沉淀。以4℃的PBS洗滌沉淀,并以4℃的PBS(5%蔗糖)重懸,保存于-20℃?zhèn)溆谩?br>　　3.STBM的鑒定及濃度的測(cè)定
　　應(yīng)用Improved-lowry蛋白定量試劑盒測(cè)定STBM的蛋白

9、濃度,小鼠組織多肽抗原ELISA試劑盒測(cè)定小鼠STBM制劑中組織多肽抗原(tissuepolypeptideantigen,TPA)含量,按照試劑盒說(shuō)明說(shuō)嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。
　　4.掃描電子顯微鏡觀察STBM的形態(tài)特征
　　將云母片置入95%酒精中浸泡1小時(shí)后取出,在酒精燈周圍小心烤干。將STBM制劑使用含5%蔗糖的PBS溶液稀釋十倍后加入等體積2.5%戊二醛固定2小時(shí)后小心吸取1滴到烤干的云母片上,自然風(fēng)干后鍍金,上機(jī)觀察

10、。
　　5.動(dòng)物模型的建立
　　將小鼠STBM制劑用PBS緩沖液(5%蔗糖)稀釋至蛋白濃度為0.14mg/ml,PS組于妊娠第10日起每日上午08:00經(jīng)尾靜脈注射稀釋后的小鼠STBM制劑,NS組對(duì)應(yīng)于相同時(shí)間進(jìn)行相同處理;PP組于妊娠第10日起每日上午08:00經(jīng)尾靜脈注射PBS溶液(5%蔗糖),NP組對(duì)應(yīng)于相同時(shí)間進(jìn)行相同處理。
　　6.尿液標(biāo)本的采集及尿蛋白的測(cè)定
　　PS組及PP組分別于孕10天、孕18天

11、使用小鼠代謝籠采集尿液。采集尿液前禁食12小時(shí),采集尿液時(shí)禁食不禁水,容器中加入1ul二甲苯用于防腐,采集12小時(shí)尿液,濾紙過(guò)濾后使用Improved-lowry蛋白定量試劑盒測(cè)定尿蛋白濃度。NS組及NP組對(duì)應(yīng)于相同時(shí)間進(jìn)行相同處理。
　　7.小鼠尾動(dòng)脈血壓的測(cè)定
　　PS組及PP組分別于孕10天、孕14天、孕18天使用小鼠無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)定尾動(dòng)脈血壓,測(cè)定之前先將小鼠全身(包括尾部)加熱,其目的是使尾動(dòng)脈擴(kuò)張,待小鼠安靜下來(lái)后

12、進(jìn)行測(cè)定,重復(fù)測(cè)定三次取平均值。NS組及NP組對(duì)應(yīng)于相同時(shí)間進(jìn)行相同處理。
　　8.血漿及臟器標(biāo)本的采集
　　PS組及PP組小鼠于孕18天腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉,待小鼠麻醉后用眼科鑷輕輕摘除小鼠眼球,用預(yù)先加入枸櫞酸鈉抗凝劑的EP管接取血液,邊接邊輕輕搖晃混勻。立即將全血置于冷凍離心機(jī)中1000r/min離心10分鐘,小心吸取上層血漿,將血漿上機(jī)測(cè)定活化部分凝血酶時(shí)間(activeatedpartialthrombopl

13、astintime,APTT)、血漿凝血酶原時(shí)間(ProthrombinTime,PT)、D-二聚體(D-Dimer,D-D)。隨后用頸椎脫臼法處死小鼠,立即將小鼠解剖,獲取腎臟、心臟,放至4%多聚甲醛溶液中固定,將胎盤及胎鼠迅速使用冰冷生理鹽水洗凈表面血跡,放至清潔紗布吸干水分后,在電子天平上稱重,隨后立即將胎盤放入4%多聚甲醛中固定。除胎盤與胎鼠的處理外,NS組及NP組余處理均與PS組及PP組對(duì)應(yīng)于相同時(shí)間進(jìn)行相同處理。
　　

14、9.HE染色觀察小鼠胎盤、腎臟、心臟的病理變化
　　將標(biāo)本放入4%多聚甲醛溶液固定48小時(shí)后,將標(biāo)本脫水、透明,浸蠟包埋,用石蠟切片機(jī)切成厚度為6um的薄片,將切片脫蠟與水化后染色,封片后觀察。
　　結(jié)果:
　　1.STBM制劑蛋白含量及TPA含量
　　測(cè)得STBM制劑總蛋白含量為0.46mg/ml-0.91mg/ml,平均值為(0.69±0.12)mg/ml,TPA濃度為45.33ng/ml-77.53ng/m

15、l,平均值(61.49±9.78)ng/ml。
　　2.在掃描電子顯微鏡下可見(jiàn)STBM為囊泡狀結(jié)構(gòu),有聚集成團(tuán)的趨勢(shì),Image-ProPlus6.0軟件測(cè)得STBM囊泡的直徑為104.47nm-472.71nm,平均值為(228.52±90.06)nm。
　　3.孕10天時(shí)PS組與PP組,NS組與NP組12小時(shí)尿蛋白量無(wú)顯著性差異。孕18天時(shí)PS組尿蛋白量較PP組明顯增多(P<0.05),在經(jīng)過(guò)STBM處理后NS組的尿蛋白

16、量較NP組顯著增多(P<0.05)
　　4.孕10天時(shí)PS組與PP組,NS組與NP組血壓之間無(wú)明顯差異。孕14天時(shí)及18天時(shí)PS組與NS組血壓較PP組與NP組顯著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001,P<0.001),PS組及NS組在整個(gè)孕期血壓呈持續(xù)上升趨勢(shì),分別與PP組及NP組比較有顯著性差異。PP組、NP組血壓無(wú)明顯變化。
　　5.PS、PP、NS、NP四組之間APTT及D-二聚體差異無(wú)顯著性,PS組與PP

17、組,NS組與NP組比較PT有顯著差異,經(jīng)過(guò)STBM處理后的PS組及NS組的PT時(shí)間均較對(duì)照組縮短(P<0.05,P<0.05)。
　　6.PS組發(fā)現(xiàn)6例胚胎停育,胎死宮內(nèi),其中2例只見(jiàn)胎盤附著于子宮壁,未見(jiàn)胎鼠,將此2例胎鼠體重計(jì)為0g,PP組未見(jiàn)死胎、胚胎發(fā)育異常等,兩組比較有顯著差異(P<0.05)。兩組胚胎數(shù)量無(wú)明顯差異,PS組胎盤重量及胎鼠重量均小于PP組(P<0.001,P<0.001)。
　　7.在光鏡下觀察,各

18、組小鼠心臟未見(jiàn)明顯心肌纖維肥大、點(diǎn)狀出血或壞死、間質(zhì)水腫等。PS組及NS組腎小球系膜細(xì)胞增生明顯,基底膜可見(jiàn)增厚,腎小管上皮廣泛水腫,PS組及NS組腎小球內(nèi)紅細(xì)胞量明顯較PP組及NP組減少。四組腎臟相比較,PS組與NS組較PP組與NP組病變明顯。鏡下可見(jiàn)胎盤蛻膜帶細(xì)胞水腫明顯,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),基帶和迷路帶可見(jiàn)滋養(yǎng)葉巨細(xì)胞大量增生,聚集成團(tuán),部分滋養(yǎng)葉巨細(xì)胞可見(jiàn)脂肪樣變,迷路帶血供減少,部分可見(jiàn)纖維蛋白沉積,血間膜變薄,部分滋養(yǎng)細(xì)胞壞死。

19、
　　結(jié)論:
　　1.本研究制備的小鼠STBM制劑在蛋白標(biāo)志及形態(tài)學(xué)上均與人類來(lái)源的STBM具有高度的相似性;
　　2.通過(guò)STBM回輸同種C57小鼠制備的子癇前期動(dòng)物模型已初步建立,該模型血壓、尿蛋白、凝血指標(biāo)、胚胎發(fā)育、腎臟及胎盤的病理表現(xiàn)均與人類PE疾病的臨床表現(xiàn)及病理表現(xiàn)相似。
　　3.這一動(dòng)物模型是從PE發(fā)病的終末階段來(lái)模擬PE的發(fā)病,對(duì)以STBM為治療靶點(diǎn)的研究提供了條件,為PE致病環(huán)節(jié)的研究提供新線