內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的調(diào)節(jié)作用及其與子癇前期的關(guān)系.pdf

1、子癇前期是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡和患病的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制至今仍不完全清楚。對(duì)子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究是目前圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)，已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，并形成了多種學(xué)說。胎盤缺血學(xué)說是其中最為重要的學(xué)說之一。這種學(xué)說認(rèn)為，妊娠期各種原因?qū)е碌淖甜B(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力降低，使胎盤形成和植入障礙，引起子宮肌層內(nèi)螺旋小動(dòng)脈的重鑄失敗，胎盤血流灌注不足，不能滿足胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的生理需求，出現(xiàn)胎盤缺血缺氧。隨后造成胎盤組織釋放大量毒性物質(zhì)，出現(xiàn)全身性母體

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能紊亂，最終母體產(chǎn)生蛋白尿、高血壓、水腫等一系列臨床癥狀，形成子癇前期。滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力受到多種因素的調(diào)節(jié)，目前認(rèn)為，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)減少和細(xì)胞過度凋亡是子癇前期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降的重要原因。 基質(zhì)金屬蛋白酶是一組依賴Zn的蛋白水解酶家族，幾乎水解所有的細(xì)胞外基質(zhì)。其中MMP-2和MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力最強(qiáng)。在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)過程中，一系列的母體細(xì)胞和它們的基底膜以及細(xì)胞外基質(zhì)是滋養(yǎng)細(xì)胞必須穿

3、過的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)中的Ⅳ型膠原、纖維蛋白原、層粘連蛋白、彈性蛋白、巢蛋白和明膠及蛋白聚糖是MMP-2和MMP-9的底物?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠相比，子癇前期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯減少。 細(xì)胞凋亡也是影響細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的重要因素。在生理功能正常的情況下，形成和維持適度的凋亡是保持細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞正常浸潤(rùn)能力的基本前提。細(xì)胞過度凋亡將導(dǎo)致有浸潤(rùn)能力的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞大量減少，導(dǎo)致胎盤形成和發(fā)育障礙。研究發(fā)現(xiàn)，子癇

4、前期胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞有過度凋亡和浸潤(rùn)不足發(fā)生，并認(rèn)為這與子癇前期的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。然而，目前并不清楚子癇前期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)減少和過度凋亡發(fā)生的原因和機(jī)制。近年來的研究表明，內(nèi)毒素與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁，在感染發(fā)生后，可被釋放入機(jī)體。已發(fā)現(xiàn)妊娠期泌尿生殖系統(tǒng)、口腔感染是子癇前期重要的誘發(fā)因素，革蘭氏陰性細(xì)菌是引起上述感染的主要菌種，而且，F(xiàn)ass等采用內(nèi)毒素制備了大鼠的子癇前期模型。在此基礎(chǔ)上

5、，我們認(rèn)為內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，即對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。 目的： 本文在體外實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面探討內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響：通過觀察內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)的調(diào)控，探討內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的調(diào)節(jié)作用；通過檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶在子癇前期胎盤組織的表達(dá)，驗(yàn)證其與子癇前期的關(guān)系。 方法： 從正常早期妊娠絨毛組織，分離細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，并采用F

6、D無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后采用RT-PCR和免疫熒光一激光共聚交檢測(cè)內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的調(diào)節(jié)作用，并采用Transwell觀察細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞在內(nèi)毒素作用后浸潤(rùn)能力改變；采用電鏡、Hoechst DNA染色、Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2、Bax和caspase-8的表達(dá)等形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法，觀察內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用；最后，通過免疫組織化學(xué)方法研究基質(zhì)金屬蛋白酶在子癇前期與正常妊娠胎盤組織的表

7、達(dá)。 結(jié)果： RT-PCR和免疫熒光一激光共聚交研究結(jié)果表明內(nèi)毒素對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)有明顯抑制作用。經(jīng)內(nèi)毒素作用24h后MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少。Trranswell證實(shí)了內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力的抑制作用：細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞穿透Transwell基底膜的數(shù)量，對(duì)照組為143.1±18.4個(gè)；內(nèi)毒素濃度為25、50、100、200ng/ml的各實(shí)驗(yàn)組分別為137.7±20.2個(gè)

8、、122.8±17.5個(gè)、78.4±19.2個(gè)、50.1±23.5個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)研究表明內(nèi)毒素對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞有明確的凋亡誘導(dǎo)作用。在倒置顯微鏡下可見，滋養(yǎng)細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多角形或長(zhǎng)梭形，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透亮。經(jīng)內(nèi)毒素處理后，細(xì)胞形狀變窄，胞漿透亮度降低，顆粒感增強(qiáng)，部分細(xì)胞突起回縮變圓，脫落呈懸浮狀，并見細(xì)胞碎片。Hoechst染色DNA在熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞核較大，染色質(zhì)分布均

9、勻；低濃度內(nèi)毒素組見大部分均染、呈藍(lán)色的細(xì)胞核，每視野可見1-3個(gè)染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，偶見細(xì)胞核裂解；高濃度內(nèi)毒素組多見染色質(zhì)濃縮狀態(tài)，細(xì)胞核裂解，可見凋亡小體。透射電鏡觀察可見凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞出芽，線粒體腫脹，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、核膜裂解。Westem blot結(jié)果表明內(nèi)毒素抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax和凋亡蛋白caspase-8在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)。內(nèi)毒素作用24小時(shí)后各濃度組與對(duì)照組比較，滋養(yǎng)細(xì)胞Bcl-2、Bax