Tiam1對絨毛膜外滋養(yǎng)細胞遷移運動影響的研究.pdf

1、前言：
　　胎盤是胚胎發(fā)育成熟，妊娠順利完成的重要因素。而胎盤中滋養(yǎng)細胞是母體與胎兒直接接觸的部分，分為細胞滋養(yǎng)層細胞、合體滋養(yǎng)層細胞和絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞。晚期囊胚著床后，絨毛膜外滋養(yǎng)細胞向子宮蛻膜層和肌層血管的進一步侵襲、遷移和分化是胎盤形成和母胎循環(huán)建立的關(guān)鍵，而且，絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞適度的侵襲、遷移是正常妊娠所必須的。絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞生物學(xué)功能過強會導(dǎo)致胎盤植入、葡萄胎及絨癌等疾病;功能過弱會導(dǎo)致子宮螺旋動脈重鑄不足，出現(xiàn)

2、流產(chǎn)、胎兒生長受限及子癇前期等病理產(chǎn)科。明確絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷徙等的調(diào)節(jié)機制，是解決上述疾病的突破口和希望所在。
　　2007年Ferretti C等提出絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞與腫瘤細胞在生物學(xué)性能方面存在著驚人的相似，包括高度的增殖能力，缺乏細胞間的接觸抑制，遷移入侵能力，可以逃脫免疫系統(tǒng)的能力等等。因此胎盤滋養(yǎng)細胞被定義為一種假惡性細胞，它的遷移和侵襲行為又被稱為“生理性轉(zhuǎn)移”。近年來，越來越多的腫瘤侵襲誘導(dǎo)或抑制基因應(yīng)

3、用于滋養(yǎng)細胞的研究，例如nm-23、Kiss-1和RKIP等這些腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因在對滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為有影響。
　　Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1)，全稱為T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1，最初是由荷蘭癌癥研究所Habets等發(fā)現(xiàn)并命名的。他們把隔離于逆轉(zhuǎn)錄病毒的侵襲性病毒變異株作為侵襲相關(guān)前病毒插入簇分析時發(fā)現(xiàn)一個單拷貝的不同于侵襲性細胞克隆BWM

4、LV-3.6的DNA片段，經(jīng)與基因庫對比及DNA印跡(Southen blot)分析，證實這是一個可影響侵襲力的基因，命名為Tiam 1基因。Tiam1屬于Rho三磷酸鳥嘌呤核苷酸水解酶(GTPases)家族。Tiam1則作為Rho蛋白家族重要成員Rac1的特異性鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)促進GDP的釋放以及與GTP的結(jié)合，它的GEF轉(zhuǎn)換功能與其蛋白的細胞膜轉(zhuǎn)位、氨基酸

5、殘基磷酸化有關(guān)。大量研究表明Tiam1基因在不同組織來源的腫瘤細胞中高表達，例如乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肝癌、直腸癌、甲狀腺癌、前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌等。而在正常上皮組織中，Tiam1通過上調(diào)E-cadherin蛋白表達對上皮細胞的遷移具有抑制作用，在腎癌腫瘤細胞中通過調(diào)節(jié)TIMP1、TIMP9的表達抑制腫瘤細胞的遷移。
　　關(guān)于Tiam1是否在滋養(yǎng)細胞中有表達，是否對滋養(yǎng)細胞的侵襲、遷移具有調(diào)節(jié)作用至今還未見任何報道。本研究將

6、通過檢測不同侵襲、遷移能力的（早孕期和孕晚期）胎盤組織中Tiam1的表達量及表達部位;并檢測其對絨毛膜外滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/svneo細胞遷移能力的變化，探討Tiam1與胎盤滋養(yǎng)細胞生物學(xué)功能改變的調(diào)節(jié)機制。
　　方法：
　　第一部分:應(yīng)用實時定量RT-PCR法，免疫組織化學(xué)和Western blot進行Tiam1的定位及定量研究，明確Tiam1在以下兩種不同分組中的表達量是否有差異:
　　以妊娠周數(shù)作為分組條件，

7、留取妊娠7～9周的正常妊娠人工流產(chǎn)和妊娠38-40周的正常足月剖宮產(chǎn)胎盤絨毛組織。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法，觀察Tiam1在早孕胎盤絨毛及足月胎盤絨毛中的表達部位。應(yīng)用RT-PCR和Western blotd分別比較Tiam1在mRNA和蛋白水平，在早孕組和足月組胎盤中的表達含量是否有差異。
　　第二部分:體外培養(yǎng)HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細胞，脂質(zhì)體2000介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)染Tiam1高表達質(zhì)粒和沉默Tiam1基因的siRNA進入絨毛膜外滋

8、養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo細胞系。Transwell法觀察不同分組的HTR-8/SVneo細胞遷移能力的變化。
　　第三部分:檢測Tiam1高表達質(zhì)粒和沉默Tiam1基因的siRNA轉(zhuǎn)染的HTR-8/SVneo細胞中β-catenin蛋白、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達差異，應(yīng)用RT-PCR檢測不同組別的N-cadherin的mRNA表達量差異，探討Tiam1基因影響HTR-8/SVneo細胞遷移能力的作用

9、機制。
　　結(jié)果：
　　第一部分:我們利用quantitative real-time RT-PCR方法檢測Tiam1 mRNA在具有不同遷移及侵襲能力的胎盤中的表達量。發(fā)現(xiàn)Tiam1在mRNA水平上，在傾向于侵襲、遷移能力弱的足月組中表達量增高，而在傾向于侵襲、遷移能力強的早孕組中表達降低;足月組中Tiam1的mRNA水平的表達量是早孕組中的8倍。免疫組化發(fā)現(xiàn)，Tiam1蛋白在足月組胎盤中表達強于早孕組絨毛，差異有統(tǒng)計學(xué)意

10、義。進一步的Western blot結(jié)果提示，足月組胎盤中的Tiam1蛋白表達顯著高于早孕組絨毛的蛋白表達量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示Tiam1可能與胎盤滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)行為有密切相關(guān)。
　　第二部分:瞬時轉(zhuǎn)染高表達的Tiam1質(zhì)粒和沉默Tiam1的干擾RNA進入HTR-8/SVneo細胞系，HTR-8/SVneo細胞的轉(zhuǎn)染效率均達到了70-80％，最佳轉(zhuǎn)染時間為48小時。轉(zhuǎn)染入高表達的Tiam1質(zhì)粒的HTR-8/SVneo

11、細胞中Tiam1蛋白的表達明顯上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染入沉默Tiam1的干擾RNA的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1蛋白的表達水平明顯下調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2-4）。Westernblot結(jié)果表明瞬時轉(zhuǎn)染高表達的Tiam1質(zhì)粒的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1的蛋白表達明顯增加了，而瞬時轉(zhuǎn)染沉默Tiam1基因的siRNA的HTR-8/SVneo細胞中Tiam1的蛋白表達則明顯下調(diào)。分別記錄在轉(zhuǎn)

12、染高表達Tiam1質(zhì)粒和沉默Tiam1的siRNA后24小時、48小時和72小時，計數(shù)穿過Transwell小室的細胞數(shù)，轉(zhuǎn)染沉默Tiam1基因的siRNA后48小時的（si組）HTR-8/SVneo細胞遷移能力增強，而轉(zhuǎn)染高表達Tiam1質(zhì)粒的（H組）HTR-8/SVneo細胞遷移能力降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。提示Tiam1可以抑制HTR-8/SVneo細胞的遷移。
　　第三部分:瞬時轉(zhuǎn)染高表達的Tia

13、m1質(zhì)粒和沉默Tiam1的干擾RNA的HTR-8/SVneo細胞，48小時后測定細胞中β-catenin蛋白、E-cadherin及N-cadherin蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)N-cadherin蛋白在Tiam1高表達組的HTR-8/SVneo細胞中的表達量是降低的，而siRNA組中的表達是明顯增加的，與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義。而β-catenin蛋白在各組中的表達無明顯差異。E-cadherin蛋白在HTR-8/SVneo細胞中未見表達。<