HCMV經(jīng)Hippo-YAP信號通路對絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞功能影響的體外研究.pdf

1、研究背景
　　人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)又稱人類皰疹病毒5型，是皰疹病毒科β亞科的一種常見病毒，廣泛存在于自然界中，人是其唯一宿主。HCMV是目前已知的引起孕婦活動性感染、胚胎及胎兒宮內(nèi)感染的最常見病原體。孕期母體感染HCMV后，可通過胎盤垂直傳播或者生殖道逆行傳播給胎兒，引起胚胎或胎兒宮內(nèi)感染。HCMV宮內(nèi)感染可導(dǎo)致胚胎停育、流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩等異常妊娠結(jié)局，以及新生兒認(rèn)

2、知能力發(fā)育落后、智力低下、感音神經(jīng)性耳聾等嚴(yán)重遠(yuǎn)期后果。目前HCMV發(fā)生宮內(nèi)傳播及引起胎兒發(fā)育異常的具體機(jī)制和途徑尚不清楚，HCMV感染胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞被認(rèn)為是啟動宮內(nèi)感染的第一步。絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous cytotrophoblast，EVT)增殖、侵襲能力下降，導(dǎo)致螺旋動脈重鑄不良，胎盤物質(zhì)交換功能低下，是流產(chǎn)、死胎、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、腦發(fā)育落后等異常妊娠的重要病理生理機(jī)制。
　　研究目的
　　體外研

3、究HCMV經(jīng)Hippo-YAP信號通路對早孕EVT功能的影響。
　　研究方法
　　1.無菌收集早孕絨毛組織，應(yīng)用改良的復(fù)合酶消化梯度離心法分離、培養(yǎng)原代EVT;
　　2.通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測CK7、Vim、c-erbB-2表達(dá)情況鑒定細(xì)胞來源;
　　3.常規(guī)培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞株，擴(kuò)增HCMVAD169病毒株，并根據(jù)Reed-Muench法測定TCID50;
　　4.將HCMVAD169病

4、毒液接種于EVT培養(yǎng)基中，通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測HCMVpp65抗原，以確定HCMV感染EVT情況;
　　5.MTT比色法檢測HCMV對EVT體外增殖的影響，為后續(xù)試驗篩選最佳病毒接種劑量;
　　6.實驗分為正常組(EVT)及病毒組(EVT+HCMV);
　　7.熒光定量PCR檢測HCMV經(jīng)Hippo-YAP信號通路對EVT表達(dá)Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP、TAZ、TEAD

5、1～4mRNA水平的影響;
　　8.免疫熒光化學(xué)染色法、Western blot技術(shù)檢測正常組及病毒組YAP蛋白水平，以了解HCMV對EVT的YAP蛋白表達(dá)的影響。
　　9.體外細(xì)胞侵襲實驗檢測HCMV對EVT侵襲功能的影響。
　　研究結(jié)果
　　1.倒置顯微鏡下見分離的原代細(xì)胞貼壁后呈三角形或不規(guī)則多邊形，平鋪片狀生長;
　　2.細(xì)胞來源鑒定結(jié)果顯示，幾乎所有分離培養(yǎng)的原代細(xì)胞均可見CK7和c-erbB-2

6、表達(dá)，極少數(shù)可見Vim表達(dá)，提示實驗中分離培養(yǎng)獲得的原代細(xì)胞為高純度EVT;
　　3.病毒擴(kuò)增后測定HCMV AD169病毒株TCID50為10-4.15/0.1 ml;
　　4.EVT培養(yǎng)基中接種HCMV后，免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示病毒組細(xì)胞內(nèi)可見大量紅色HCMV pp65抗原陽性信號表達(dá)，正常組細(xì)胞內(nèi)未見陽性信號表達(dá);
　　5.MTT檢測顯示，與正常組相比較，接種病毒48h時，30μl、40μl、50μl、70μl

7、、100μlHCMV病毒液對EVT增殖有明顯抑制作用(P＜0.05)，30μl、40μl、50μl各組間無明顯差異（P＞0.05），故選擇30μl100TCID50 HCMV/120μl培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)實驗;
　　6.熒光定量PCR顯示，兩組EVT中均有Mst1、Mst2、SAV、Lats1、Lats2、Mob1、YAP、TAZ、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4基因mRNA表達(dá)，各基因mRNA相對表達(dá)量正常組為（1.0

8、00±0.014，1.000±0.036，1.000±0.025，1.001±0.047，1.000±0.016,1.001±0.067,1.002±0.067,1.000±0.017,1.001±0.053,1.001±0.050,1.000±0.039，1.009±0.160）、病毒組為（(0.805±0.015，0.818±0.027，0.929±0.021，0.721±0.032，0.734±0.005,0.388±0.019,

9、0.623±0.022,0.587±0.012,0.488±0.010,0.501±0.012,0.652±0.016，0.625±0.026)，病毒組與正常EVT組相比較，各基因mRNA表達(dá)水平明顯降低（P均＜0.05）;
　　7.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測結(jié)果顯示兩組細(xì)胞均有YAP蛋白表達(dá)，正常組EVT細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有YAP蛋白表達(dá)，病毒組EVT表達(dá)YAP細(xì)胞核定位減少，正常組與病毒組陽性細(xì)胞的平均光密度值(averag

10、e optical density，AOD)分別為0.271±0.024和0.159±0.017，與正常EVT組相比較，病毒組EVT表達(dá)YAP蛋白水平明顯降低(P＜0.05);
　　8.Western blot檢測顯示兩組細(xì)胞均有YAP蛋白表達(dá)，正常組與病毒組YAP蛋白表達(dá)的灰度值分別為1.02±0.056和0.65±0.071，與正常EVT組相比較，病毒組EVT表達(dá)YAP蛋白水平明顯降低(P＜0.05);
　　9.體外細(xì)胞

11、侵襲實驗結(jié)果顯示正常組和病毒組EVT均有細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠，兩組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（55.7±2.95）個和(47.9±3.21)個，與正常組相比較，病毒組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)，提示HCMV降低EVT侵襲活力。
　　結(jié)論
　　1.EVT是HCMV的允許細(xì)胞，HCMV可體外感染EVT，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并抑制其增殖，EVT感染HCMV可作為HCMV宮內(nèi)感染的模型;
　　2.HCMV可能影響EVT細(xì)胞Hipp