Hippo信號(hào)通路調(diào)控心肌細(xì)胞增殖機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　隨著生活水平提高和生活方式的轉(zhuǎn)變，我國(guó)冠心病發(fā)病率逐年升高。雖然目前的臨床治療技術(shù)的進(jìn)步使心肌梗死的早期死亡率明顯降低，但是心肌梗死患者往往會(huì)出現(xiàn)生活質(zhì)量下降，并最終發(fā)展成有癥狀的心力衰竭。其根本原因在于心肌梗死伴隨心肌細(xì)胞數(shù)量減少(死亡或凋亡)，心臟結(jié)構(gòu)的病理性重塑，最終心功能進(jìn)行性的惡化。因此深入研究解決因細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致的心臟病理生理改變的新途徑，對(duì)提高心肌梗死患者存活率和生存質(zhì)量具有重要意義。目前Hippo

2、信號(hào)系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物的器官發(fā)育水平控制的研究是熱點(diǎn)。已有的研究提示Hippo信號(hào)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物的肝臟等發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但是有關(guān)Hippo信號(hào)通路在心臟中的研究較少，且Hippo信號(hào)系統(tǒng)對(duì)心臟發(fā)育和心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制仍然不明確。
　　研究目的:
　　本課題將通過(guò)觀察大鼠出生后心肌細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)變過(guò)程中Hippo信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵組分的表達(dá)變化及通過(guò)Hippo信號(hào)關(guān)鍵組分過(guò)度表達(dá)或表達(dá)不足分別對(duì)大鼠H9C2心肌細(xì)胞系增殖影響的

3、研究，進(jìn)一步闡明Hippo通路對(duì)心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，從而為后續(xù)的心肌梗死后心肌細(xì)胞再生治療開(kāi)拓新思路和提供必要的理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　研究?jī)?nèi)容分兩部分：
　　(1)觀察大鼠出生后各周齡心肌組織中Hippo信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵組分YAP、P-YAP及其上游組分LATS1/2的表達(dá)變化。應(yīng)用RT-PCR法和Western Blot方法檢測(cè)Hippo信號(hào)系統(tǒng)關(guān)鍵組分YAP、磷酸化YAP(P-YAP)及其上游組分LATS

4、1/2的在大鼠出生后各周齡心肌組織中的表達(dá)變化；應(yīng)用免疫組化方法包括DAB染色和免疫熒光激光共聚焦研究YAP，P-YAP及LATS1/2在細(xì)胞內(nèi)的定位及表達(dá)特點(diǎn)。
　　(2)通過(guò)Hippo信號(hào)關(guān)鍵組分過(guò)度表達(dá)或表達(dá)不足觀察大鼠H9C2心肌細(xì)胞的增殖行為。我們通過(guò)構(gòu)建含LATS1的質(zhì)粒即pIRES2-EGFP-LATS1，過(guò)度表達(dá)Hippo信號(hào)關(guān)鍵組分LATS1，借助EDU摻入增殖實(shí)驗(yàn)和CCK8增殖檢測(cè)法觀察大鼠H9C2心肌細(xì)胞的增

5、殖變化；同時(shí)通過(guò)設(shè)計(jì)和篩選針對(duì)YAP和LATS1的小干擾RNA(siRNAs)觀察大鼠H9C2心肌細(xì)胞的增殖變化。
　　研究結(jié)果:
　　(1)同出生1d的大鼠心臟組織相比，在出生后1w、2w、4w、6w和8w的大鼠心臟組織中，YAP基因的mRNA和蛋白水平未見(jiàn)明顯變化，且在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)；但是P-YAP隨著周齡增加在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加，且主要定位在核內(nèi)。隨著周齡增加，LATS1在心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)增加，同時(shí)核內(nèi)表

6、達(dá)尤其明顯，其表達(dá)特點(diǎn)與p-YAP相似。但是LATS2的表達(dá)在大鼠出生后各周齡未見(jiàn)明顯變化，且LATS2在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)。
　　(2)本文針對(duì)YAP和LATS1基因設(shè)計(jì)了若干對(duì)siRNAs，利用RT-PCR反應(yīng)和蛋白印跡驗(yàn)證。經(jīng)轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)siLA1組相對(duì)于siCON對(duì)照組Edu陽(yáng)性細(xì)胞比例及OD值有明顯的增多(P<0.05)，而siYAP組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例和OD值相對(duì)于siCON對(duì)照組Edu陽(yáng)性細(xì)胞比

7、例有明顯減少(P<0.05)。
　　(3)應(yīng)用分子克隆技術(shù)，我們成功構(gòu)建了含有LATS1的真核表達(dá)載體。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染和G418篩選而穩(wěn)定表達(dá)后，我們發(fā)現(xiàn)pIRES2-EGFP-LATS1重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例及OD值相對(duì)于空白質(zhì)粒對(duì)照組有明顯的降低(P<0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　Hippo信號(hào)系統(tǒng)在大鼠出生后心肌細(xì)胞增殖潛能轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著重要作用。Hippo信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵組分蛋白YAP磷酸化水平調(diào)節(jié)