乳香樹脂提取物對日本血吸蟲感染小鼠肝臟肉芽腫和纖維化的抑制作用及其機(jī)制.pdf

1、血吸蟲病依然是我國亟待解決的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題,該病主要死因是肝臟蟲卵肉芽腫及其繼發(fā)的肝纖維化,血吸蟲肝肉芽腫和纖維化是血吸蟲蟲卵分泌SEA誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的病理結(jié)果?；煂σ研纬傻南x卵或纖維化已無能為力。乳香樹脂提取物(extractsoftheoleogumresinfromBoswelliaserrate,BSE)有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,已被用于治療炎癥性結(jié)腸炎、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)病等一些炎癥和免疫性疾病的臨床前期試驗(yàn),

2、并取得良好的效果,且副作用小?，F(xiàn)有研究顯示乳香酸可以通過抑制IκB激酶(IKK)的活性而調(diào)控NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)。迄今為止,BSE對血吸蟲肝臟肉芽腫及纖維化的治療作用未見文獻(xiàn)報(bào)道,因此,本實(shí)驗(yàn)首先觀察乳香樹脂提取物抑制血吸蟲蟲卵肉芽腫和纖維化的作用,再分別從細(xì)胞和分子水平初步分析了BSE對血吸蟲肝臟肉芽腫及纖維化的治療作用機(jī)理,為控制血吸蟲蟲卵肉芽腫和肝纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為2個(gè)部分:一、乳香樹脂提取物對日本血吸蟲感染小鼠

3、肝臟肉芽腫的抑制作用及其機(jī)制;二、乳香樹脂提取物對日本血吸蟲感染小鼠肝臟纖維化的抑制作用及其機(jī)制。
　　一、乳香樹脂提取物對日本血吸蟲感染小鼠肝臟肉芽腫的作用及其機(jī)制
　　利用20條日本血吸蟲尾蚴感染C57/BL6小鼠制備肝蟲卵肉芽腫動(dòng)物模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分5組:BSE-CD(280mg/kg)組,BSE-CD(140mg/kg)組,環(huán)糊精(cyclodextrin,CD,280mg/kg)組,模型對照組(infectedmi

4、ce)和正常對照組(normalmice)。針對小鼠肝肉芽腫模型,我們在感染后4周用不同劑量的BSE或者環(huán)糊精經(jīng)腹腔注射治療,每天1次,共3周,最后一次治療后24h處死小鼠。然后檢測BSE-CD治療對感染血吸蟲C57BL/6小鼠的肉芽腫炎癥反應(yīng)及肝臟損傷的影響。采用EMSA和免疫組化技術(shù)檢測BSE-CD治療對小鼠肝組織IKK-NF-κB信號(hào)通路的影響;RT-qPCR法分析BSE-CD治療對小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響;最

5、后利用ELISA、RT-qPCR和Westernbolt檢測BSE-CD治療對小鼠MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)的影響。
　　結(jié)果表明:肉眼可見BSE-CD(280mg/kg)處理組小鼠肝臟的肉芽腫炎癥反應(yīng)明顯減輕;HE染色的肝臟病理切片顯示BSE-CD(280mg/kg)治療后,肝臟肉芽腫面積顯著小于模型對照組和環(huán)糊精組(P<0.05);肝細(xì)胞壞死明顯減輕,血清中轉(zhuǎn)氨酶(AST/ALT)水平也相應(yīng)顯著下降(P<0.05);

6、而BSE-CD治療對感染小鼠的蟲荷、卵荷、沒有明顯影響(P>0.05);利用磷酸化IκB激酶(IKK)抗體通過免疫組化檢測磷酸化的IKK,發(fā)現(xiàn)BSE-CD(280mg/kg)組小鼠肉芽腫周圍炎癥細(xì)胞磷酸化的IKK明顯減少(P<0.05),證實(shí)BSE-CD(280mg/kg)可抑制IKK的磷酸化;凝膠遷移遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)顯示BSE-CD(280mg/kg)治療組小鼠肝臟組織中NF-κB活性顯著下調(diào)(P<0.05);定量PCR結(jié)果證實(shí)

7、BSE-CD(280mg/kg)組肝組織的MCP-1、TNF-α和VEGF的mRNA水平顯著下調(diào)(P<0.05),IL-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型對照組和環(huán)糊精組,但兩組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但BSE-CD治療對IL-13和TGF-β的mRNA水平無影響;Westernbolt和定量PCR結(jié)果證實(shí)證實(shí)BSE-CD(280mg/kg)和BSE-CD(140mg/kg)治療均可顯著下調(diào)肝組織MMP-9的基因和蛋白表達(dá)水平(P<

8、0.05);ELISA法檢測證實(shí)BSE-CD(280mg/kg)治療可下調(diào)LTB4和PGE2的表達(dá)(P<0.05)。
　　總之,BSE-CD早期干預(yù)可以減輕血吸蟲感染小鼠的急性期肝臟肉芽腫病變,減輕肝細(xì)胞壞死,同時(shí)伴有抑制NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo),下調(diào)肝組織MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)BSE-CD治療可下調(diào)MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)。故BSE-CD抑制肝肉芽腫的機(jī)制之一是通過抑制IKK的活性而下調(diào)NF-

9、κB的信號(hào)傳導(dǎo),下調(diào)MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá);同時(shí)還與BSE-CD抑制一些生化介質(zhì),如MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)相關(guān)。
　　二、乳香樹脂提取物對日本血吸蟲感染小鼠肝臟纖維化的作用及其機(jī)制
　　利用血吸蟲尾蚴感染C57/BL6小鼠制備肝纖維化模型,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分5組:BSE-CD(280mg/kg)組,BSE-CD(140mg/kg)組,環(huán)糊精(cyclodextrin,CD,280mg/kg)組,模型對

10、照組(infectedmice)和正常對照組(normalmice)。針對小鼠肝纖維化模型,并于感染后42天經(jīng)胃灌吡喹酮(500mg/kg/dx2d),在感染后7周用同不同劑量的BSE或者環(huán)糊精經(jīng)腹腔注射治療,每天1次,共治療21天,最后一次治療后24h處死小鼠。肝臟組織切片Masson染色檢測BSE-CD對感染血吸蟲C57BL/6小鼠治療后對肝纖維化的影響;檢測血清肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)和層粘連蛋白

11、(laminin,LN)LN;采用免疫組化檢測BSE-CD治療對小鼠肝組織α-SMA的影響;RT-qPCR法分析BSE-CD治療對小鼠肝組織炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響。體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells,HSC)-T6,采用MTT法檢測BSE-CD對的HSC-T6增殖作用,Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測BSE-CD對活化HSC-T6凋亡形態(tài)和凋亡率的影響。
　　結(jié)果表明:Masson

12、染色證實(shí)BSE-CD(280mg/kg)治療組肝臟纖維化的面積明顯減少(P<0.05);BSE-CD(280mg/kg)治療對血清中HA和LN沒有影響((P>0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果提示:BSE-CD(280mg/kg)組小鼠肝臟α-SMA表達(dá)面積較模型對照組和環(huán)糊精組下降32.3％(P<0.05);定量PCR結(jié)果證實(shí)BSE-CD(280mg/kg)組肝組織的MCP-1、TNF-α和VEGFmRNA水平顯著下調(diào)(P<0.05),IL

13、-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型對照組和環(huán)糊精組,但兩組之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但BSE-CD治療對IL-13和TGF-β的mRNA水平無影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BSE-CD(0.25-0.2mg/ml)能顯著抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖,并呈一定的量效關(guān)系;Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)BSE-CD(0.25-0.2mg/ml)作用HSC-T648h能誘導(dǎo)HSC-T6凋亡,同對照組相比,凋亡率顯著增加(P<0.05)