肝癌轉(zhuǎn)移特征性microRNAs的篩選及功能鑒定.pdf

1、論文題目肝癌轉(zhuǎn)移特征性microRNAS的篩選及功能鑒定SereeningandMetastasis一assoeiatedMieroRNAsIdentifieationofinHumanHePatoeellularCareinoma導(dǎo)師組成員:孫惠川教授王魯副教授本課題由國家自然科學(xué)基金(30670953，81071904)和國家科技重大專項(2008ZX10002一021)項目資助復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要背景與目的:miCrNAs

2、(miRNAs)是一種短鏈非編碼小RNA，通過與其靶基因mRNA3’UTR區(qū)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后抑制作用，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、分化、代謝、運動以及參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近年來有研究證實，miRNAS的差異表達與肝癌的轉(zhuǎn)移、藥物治療反應(yīng)性以及預(yù)后相關(guān)。本研究著重探索人肝癌轉(zhuǎn)移過程中差異表達miRNAs，并鑒定其中關(guān)鍵miRNAS的生物學(xué)功能，以期進一步理解肝癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為肝癌的個體化治療提供線索。方法:應(yīng)用miRNAs表達譜芯片檢測裸鼠原位

3、移植瘤肝癌原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶中miRNA表達，根據(jù)SAM的差異倍數(shù)篩選肝癌侵襲轉(zhuǎn)移鏈特異性差異表達miRNAS譜利用生物信息學(xué)技術(shù)分析并構(gòu)建差異表達miRNAS的生物學(xué)事件調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Poly(A)real一tifnePCR檢測miRNAS的表達水平Real一timePCR和Westernblot分別檢測功能基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平Trans一wen和BDMatrigel用來觀察細(xì)胞的遷移、侵襲能力進而對miR612的靶基因及相關(guān)信號通路進

4、行生物信息學(xué)再預(yù)測和功能富集分析構(gòu)建Dual一LuCiferaserepterveCt直接驗證miR612的靶基因。通過miR丁DINAmimie和hairpininhibit及LipofeCtamin2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，實現(xiàn)miR612的瞬時過表達或封閉表達。利用AKTZ選擇性抑制劑VIH阻斷AKTZ的活化和下游信號通路的激活。尾靜脈注射裸鼠模型在體觀察腫瘤的肺轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果:1)在肝癌侵襲一轉(zhuǎn)移鏈中特異性差異表達miRNAS有32

5、條，其中上調(diào)15條，下調(diào)17條聚類分析可將上述32條差異表達miRNAS歸類為原發(fā)灶和肺轉(zhuǎn)移灶兩種獨特表達模式根據(jù)預(yù)測的靶基因這些差異表達miRNAS可能參與18項生物學(xué)事件2)在HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L、HepGZ和SMMC一7721中miR612的表達水平呈逐漸升高趨勢，其中SMMC一7721的表達水平是HCCLM3的巧倍，表明miR612的表達水平與不同來源肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān):3)在HCCLM3、M

6、HCC97H及MHCC97L細(xì)胞中miR612的水平與其遷移、侵襲能力呈反向關(guān)系在HCCLM3不同亞克隆中，miR612表達也存在顯著性差異，而這種差異與不同亞克隆的遷移、侵襲能力呈負(fù)相關(guān)。4)miRID工NAmimiCS瞬時轉(zhuǎn)染能夠顯著抑制HCCLM3、HePGZ細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而hairPininhibit封閉miR61272h后可顯著增加遷移和侵襲能力5)應(yīng)用miRa，TargetSCan以及mirargetZ方法對miR6