2型糖尿病差異表達(dá)microRNAs的鑒定及功能研究.pdf

1、microRNAs是由21-25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，它通過(guò)與靶基因的3’-UTR的配對(duì)，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)，近年來(lái)，其與各種疾病的關(guān)系的研究成為熱點(diǎn)。2型糖尿病作為一種代謝性疾病，大量研究工作集中于2型糖尿病編碼蛋白的易感基因篩查和功能的鑒定，關(guān)于microRNAs與此疾病的關(guān)系知之甚少。本實(shí)驗(yàn)以國(guó)際上公認(rèn)的2型糖尿病模型—Goto-Kakizaki大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用microRNAs芯

2、片篩查GK大鼠與健康對(duì)照Wistar大鼠的骨骼肌中差異表達(dá)的microRNAs。設(shè)定閥值1.5倍，SAM軟件分析找到15個(gè)差異表達(dá)的microRNAs，與健康對(duì)照組比較，其中上調(diào)的有4個(gè)(miR*29a、miR-29b、miR-29c和miR-150)，下調(diào)的有11個(gè)(miR-379、miR-127、miR-299-5p、miR-434-3p、miR-335、miR-130a、miR-19b、miR-451、miR-148a、miR-1

3、99a和miR-152)。Northern雜交驗(yàn)證結(jié)果為，表達(dá)豐度較高的上調(diào)的四個(gè)microRNAs與芯片結(jié)果完全一致，下調(diào)的microRNAs中，如miR-152豐度較低，且與芯片結(jié)果不一致，其表達(dá)量在兩組間沒(méi)有差異；miR-130a、miR-19b和miR-434-3p與芯片結(jié)果一致，而其他下調(diào)的microRNAs則可能因豐度甚低，Northern雜交沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)。 依據(jù)高胰島素和高葡萄糖是2型糖尿病最典型的特征，我們?cè)?

4、T3-L1脂肪細(xì)胞中，以高胰島素聯(lián)合高葡萄糖處理細(xì)胞24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)miR-29a和miR-29b的表達(dá)增加，而48小時(shí)后僅miR-29b的表達(dá)差異顯著，說(shuō)明高胰島素和高葡萄糖是miR-29表達(dá)上調(diào)的一個(gè)誘因，但可能還有其他因素的作用。接著用腺病毒為載體高量表達(dá)miR-29，結(jié)果顯示，胰島素刺激葡萄糖吸收的增加受到抑制(50％)，而這種抑制作用可被miR-29的抑制劑處理細(xì)胞部分抵消，使上述抑制效率從50％降低至24％。免疫熒光的結(jié)果表

5、明，過(guò)表達(dá)miR-29使得胰島素誘導(dǎo)的GLUT4向細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)受到了抑制。同時(shí)與高胰島素高葡萄糖作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素抵抗效應(yīng)一樣，Akt的激活也受到抑制，雖然miR-29所產(chǎn)生的抑制程度不及后者顯著，但是綜合前面的結(jié)果我們可以得出miR-29的過(guò)量表達(dá)在細(xì)胞水平上能產(chǎn)生胰島素抵抗效應(yīng)。測(cè)序分析miR-29的前體序列發(fā)現(xiàn)，僅miR-2962的前體序列有2個(gè)核苷酸的多態(tài)性，且位于前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)，但是克隆表達(dá)GK大鼠和對(duì)

6、照大鼠來(lái)源的pri-miR-29b2，經(jīng)Northern雜交證實(shí)此多態(tài)性并不影響miR-29b2的加工成熟和表達(dá)。經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)后克隆鑒定了pri-miR-29b2的啟動(dòng)子區(qū)域，預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子序列在大鼠和小鼠內(nèi)是完全一致的，且上游400bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)Myod的結(jié)合位點(diǎn)也是完全保守的。雖然此啟動(dòng)子和Myod的結(jié)合位點(diǎn)在人類是不保守的，但是Northern雜交實(shí)驗(yàn)同樣證明Myod可激活miR-29b和miR-29c的表達(dá)，后經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

7、發(fā)現(xiàn)，人的啟動(dòng)子區(qū)域上游也存在2個(gè)相鄰的Myod的結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)橐葝u素能在骨骼肌細(xì)胞(C2C12和L6)中誘導(dǎo)Myod的表達(dá)，據(jù)此我們提出一個(gè)模型為：高胰島素刺激Myod的表達(dá)，后者則誘導(dǎo)miR-29b和miR-29c的表達(dá)。然而無(wú)論是高胰島素和高葡萄糖導(dǎo)致的miR-29b的表達(dá)上調(diào)，還是Myod誘導(dǎo)的miR-29b和miR-29c的表達(dá)增加均不能解釋2型糖尿病個(gè)體內(nèi)miR-29家族三個(gè)成員的表達(dá)同時(shí)上調(diào)這一結(jié)果。 綜合前面的結(jié)