自制多器官保存液對犬腎單純低溫保存的實驗研究.pdf

1、器官保存是移植的三大技術(shù)支柱之一。為了緩解供器官短缺的矛盾和不斷提高患者長期存活率，移植臨床對器官保存技術(shù)提出了更高的要求。單純靜態(tài)低溫保存仍然是最簡便和常用的器官保存方法，單純低溫保存中常使用的器官保存液包括HTK(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate)液、Celsior液和UW(UniversityofWisconsin)液。其中UW液可以成功保存犬腎臟在72小時以上，保存肝臟在30小時左右，是器官保

2、存液的金標準，但是其成分復雜、價格昂貴，配方存在兩高問題：高鉀、高粘滯度，而且使用中暴露出一些缺點，不能完全適應臨床需要。 國內(nèi)目前大器官移植、多臟器聯(lián)合移植迅速開展，但是迄今還沒有成功研制出國產(chǎn)長效多器官保存液，無法滿足日益增長的移植臨床需要。實現(xiàn)多器官保存液的國產(chǎn)化是我國器官保存研究的重點。 該文在吸取國內(nèi)外器官保存液的優(yōu)點的基礎上，配制了自制多器官保存液(SMO液)，并通過離體犬腎低溫保存期間皮質(zhì)形態(tài)學改變、線粒體

3、功能改變以及保存期間腎皮質(zhì)細胞能量代謝的測定，研究其對犬腎臟的低溫保存效果。 實驗目的 1、建立犬離體腎臟單純低溫保存模型，在低溫保存的各時點，對光鏡和電鏡下的腎皮質(zhì)細胞的水腫、胞質(zhì)空泡化、腎小管壞死、線粒體水腫、嵴破壞等形態(tài)學指標進行描述性研究，比較不同保存液組腎皮質(zhì)顯微和超微結(jié)構(gòu)變化，特別是線粒體在低溫保存中的損傷程度。同時檢測保存期間皮質(zhì)細胞凋亡的發(fā)生，了解低溫缺氧損傷中細胞凋亡的規(guī)律，及不同保存液對低溫誘導的腎皮

4、質(zhì)細胞凋亡的影響。 2、離體犬腎低溫保存期間，分離得到腎皮質(zhì)線粒體，檢測線粒體功能的改變，主要包括線粒體呼吸控制率(RCR)和磷氧比(P/O)，借此反映保存期間呼吸鏈的整體活性和細胞氧化磷酸化生成ATP的效率。通過檢測線粒體功能結(jié)合線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變，可間接反映低溫保存期間線粒體通透性(MPT)的改變，把低溫缺氧損傷后不同保存液組皮質(zhì)線粒體的形態(tài)和功能變化聯(lián)系起來研究。檢測低溫保存中腎皮質(zhì)勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)含量和超氧

5、化物歧化酶(SOD)酶活性的改變，研究線粒體氧化應激或低溫誘導產(chǎn)生反應性氧族(ROS)對質(zhì)膜的損傷和保存液中成分的保護作用。 3、離體犬腎低溫保存期間，檢測腎皮質(zhì)ATP、ADP、AMP含量的改變，了解低溫缺氧狀態(tài)下細胞內(nèi)能量代謝的變化規(guī)律，和不同保存液對腺苷酸含量的影響。低溫缺氧狀態(tài)下細胞內(nèi)能量代謝狀態(tài)反映細胞的活性，也是衡量保存效果的重要指標。通過測定細胞內(nèi)總腺苷酸含量(TAN)的改變，計算能荷(EC)、腺苷酸比值，更精確反映

6、保存期間細胞能量代謝狀態(tài)的變化。 實驗方法 1、建立犬離體腎臟單純低溫保存模型。 2、檢測腎皮質(zhì)線粒體功能的改變，主要指標包括線粒體呼吸控制率和磷氧比。 3、應用高效液相系統(tǒng)(HPLC)檢測低溫保存期間腺苷酸含量的改變。 結(jié)果 1、光鏡和電鏡病理檢查結(jié)果。發(fā)現(xiàn)HC-A液組病理改變最明顯，在各個時點都比其他兩組嚴重。光鏡下HC-A液組保存24小時腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，腎小管上皮細胞少量

7、腫脹變性；48小時后腎小管上皮廣泛中重度空泡樣改變，多處小灶狀壞死，間質(zhì)明顯水腫，細胞解離分開，刷狀緣損害明顯，基底膜裸露；72小時后腎小管上皮呈廣泛點、大片狀壞死，曲管結(jié)構(gòu)不清。SMO液組、UW液組光鏡所見保存24小時，腎組織結(jié)構(gòu)輪廓清晰，少量腎小管輕度濁腫變性；保存48小時后，腎小管上皮細胞小灶狀壞死，間質(zhì)輕度水腫，刷狀緣破壞；72小時后腎小管上皮廣泛且嚴重的濁腫變性，部分細胞破碎、壞死。電鏡所見，保存24小時，HC-A液組、UW液

8、組、SMO液組細胞核改變、線粒體腫脹或縮短相似。HC-A液組48小時核嚴重變形，線粒體顯著腫脹、嵴斷裂、溶解；72小時腎小管細胞核、線粒體嚴重破壞，結(jié)構(gòu)崩解。UW液組和SMO液組保存48小時核略變形，核質(zhì)邊聚，線粒體多數(shù)腫脹，嵴減少、溶解;72小時后細胞核變形、核質(zhì)固縮，線粒體嚴重腫脹、破裂。 2、TUNEL法檢測犬腎保存期間腎皮質(zhì)細胞凋亡情況。發(fā)現(xiàn)保存超過2小時皮質(zhì)細胞的凋亡就發(fā)生了(AI=2.3％)，而且隨保存時間的延長而增

9、加，在保存72小時HC-A液組凋亡指數(shù)可以達到22％左右。在保存2小時SMO液組、UW液組中細胞凋亡率與HC-A液組相似，保存時間超過24小時后HC-A液組凋亡指數(shù)增加比UW液組、SMO液組更迅速，各時點凋亡指數(shù)顯著高于SMO液組(P＜0.05)。保存72小時后SMO液組腎皮質(zhì)細胞凋亡率可以達到17.0±2.7％。UW液組的凋亡發(fā)生也隨保存時間的延長而平穩(wěn)增加，與SMO液組無顯著差異。低溫保存的第四天，HC-A液組凋亡指數(shù)增加不明顯，H

10、C-A液組和SMO液組間差異不顯著，說明在保存末期，細胞面臨崩解，死亡以壞死為主。 3、線粒體活性改變。隨著低溫保存時間的延長，HC-A液組和SMO液組和UW液組腎皮質(zhì)線粒體呼吸Ⅲ態(tài)耗氧速率和線粒體呼吸控制率、磷氧比下降。除保存當天外，其余時點HC-A液組腎皮質(zhì)線粒體Ⅲ態(tài)呼吸耗氧速率均低于SMO液組，且兩組間差異顯著(P＜0.05)。低溫保存期間HC-A液組、SMO液組和UW液組的Ⅳ態(tài)呼吸耗氧速率均有輕度的升高，多數(shù)時點實驗組和

11、對照組間無顯著差異(P＞0.05)。低溫保存的各時點，SMO液組皮質(zhì)RCR、P/O明顯高于HC-A組，兩組間線粒體功能差異顯著(P＜0.05)；SMO液組腎皮質(zhì)保存當天RCR能夠達到3.12±0.28，接近正常值，而HC-A液組RCR已經(jīng)下降到3以下；SMO液組RCR三天后降為2.05±0.22，而HC-A液組RCR值下降的比較快，三天后僅為1.62±0.25。低溫保存期間SMO液組皮質(zhì)線粒體P/O比值顯著高于HC-A液組，前者線粒體氧

12、化磷酸化生成ATP的效率顯著高于后者。而UW液組呼吸Ⅲ態(tài)耗氧速率、線粒體呼吸控制率、磷氧比數(shù)值呈現(xiàn)和SMO液組相似的下降趨勢，兩組間差異不顯著(P＞0.05)。 4、低溫保存期間，HC-A液組、UW液組和SMO液組腎皮質(zhì)MDA含量增加。HC-A液組腎皮質(zhì)在保存1-3天內(nèi)MDA含量顯著高于SMO液組和UW液組(P＜0.05)。SMO液組和UW液組低溫保存期間MDA增加不顯著，兩組間差異不明顯。低溫保存期間，實驗組和對照組腎皮質(zhì)SO

13、D酶活性均未出現(xiàn)與低溫缺血損傷程度相一致的改變，未發(fā)現(xiàn)反映不同損傷程度的組間差異。 5、低溫保存期間細胞能量代謝的改變。犬腎低溫保存期間，隨保存時間延長，SMO液組、UW液組、HC-A液組腎皮質(zhì)中ATP、ADP、AMP和總腺苷酸(TAN=ATP+ADP+AMP)的含量下降，HC-A液組中腎皮質(zhì)ATP含量在低溫保存期間下降的最為明顯。保存兩個小時后，SMO液組皮質(zhì)內(nèi)ATP的含量為3.9±0.4nmol/mgpro，保存72小時下降

14、為2.3±0.5nmol/mgpro；而HC-A液組保存兩小時后腎皮質(zhì)ATP含量為3.4±1.1nmol/mgpro，72小時后降為1.6±0.2nmol/mgpro；在犬腎低溫保存的各時點，SMO液組皮質(zhì)ATP水平高于HC-A液組(P＜0.05)。SMO液組和HC-A液組TAN、能荷數(shù)值隨保存時間延長而降低，在多數(shù)時間點兩組間有顯著差異(P＜0.05)。在犬腎低溫保存的多個保存時點，SMO液組皮質(zhì)ATP/AMP比值比HC-A液組高(P

15、＜0.05)，但是ATP/ADP比值兩組差異不顯著。低溫保存期間SMO液組腎皮質(zhì)中ATP、ADP、AMP的含量及ATP/ADP、ATP/AMP比值、能荷數(shù)值與UW液組無顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)論 SMO液保存的腎臟皮質(zhì)細胞變性、壞死和線粒體腫脹、破裂較同一時間點的HC-A液組輕；低溫保存期間SMO液組腎皮質(zhì)細胞凋亡率低，與HC-A液組有顯著差異(P＜0.05)；保存各時點SMO液組線粒體呼吸控制率和磷氧比及Ⅲ態(tài)呼吸

16、耗氧速率顯著高于HC-A液組(P＜0.05)，說明SMO液組線粒體功能在低溫保存期間得到了更好的保護；低溫保存期間，HC-A液組腎皮質(zhì)在保存1-3天內(nèi)MDA含量顯著高于SMO液組和UW液組(P＜0.05)；同時我們通過測定保存期間細胞腺苷酸含量的變化，并且計算總腺苷酸含量、能荷、腺苷酸比值，發(fā)現(xiàn)低溫保存期間SMO液組細胞高能磷酸化合物含量高于HC-A液組(P＜0.05)，細胞能量代謝更為活躍。但以上各項形態(tài)和功能指標SMO液組與UW液組

17、變化趨勢相似，兩組間無明顯差異(P＞0.05)。犬腎離體腎臟單純低溫保存的病理和生化功能的研究結(jié)果提示，SMO液可以減輕皮質(zhì)細胞低溫缺血損傷、減少細胞凋亡、保護線粒體功能、抑制自由基損傷、提高組織中ATP含量、改善細胞能量代謝狀態(tài)，認為SMO液對腎臟皮質(zhì)低溫缺血損傷的保護效果比HC-A液好，而與UW液的對腎臟皮質(zhì)的保護效果相似，而且SMO液改進了UW液的高鉀、高粘滯度的缺點，配方簡單有效，使用方便、成本低廉，因此更具有臨床應用前景。