缺氧誘導(dǎo)Neuroglobin上調(diào)的調(diào)控機(jī)制和以Neuroglobin為靶分子篩選神經(jīng)保護(hù)藥物的研究.pdf

1、第一部分：缺氧誘導(dǎo)Neuroglobin上調(diào)的調(diào)控機(jī)制
　　 Neuroglobin(Ngb)是新近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)特異性表達(dá)的攜氧蛋白，主要在脊椎動(dòng)物神經(jīng)組織中高表達(dá)。以前的研究表明，缺氧可以誘導(dǎo)大腦中Ngb基因的表達(dá)的上調(diào)，而增加Ngb的表達(dá)可以進(jìn)一步保護(hù)大腦免受缺血缺氧引發(fā)的損傷。然而，Ngb在缺氧條件下的調(diào)控機(jī)制尚不是很清楚。在這個(gè)研究中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠Ngb基因的近端啟動(dòng)子約554bp的序列高度保守，并且這段區(qū)域包含幾個(gè)保守的

2、NFκB和Egr1結(jié)合位點(diǎn)。過(guò)表達(dá)或者干擾轉(zhuǎn)錄因子p65，p50，Egr1或者Sp1能夠增加或者降低Ngb基因的表達(dá)。Ngb基因啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變研究以及凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)和染色體免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明了NFκB家族成員(包括p65，p50和cRe1)以及Egr1和Sp1能夠與Ngb基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)κB3位點(diǎn)作為一個(gè)關(guān)鍵的順式作用原件介導(dǎo)了缺氧條件下誘導(dǎo)Ngb基因啟動(dòng)子活性的上調(diào)。轉(zhuǎn)錄

3、因子NFκB(p65)，Sp1參與了調(diào)控缺氧條件下Ngb基因的表達(dá)上調(diào)。盡管我們?cè)谛∈驨gb基因的近端啟動(dòng)子區(qū)域并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HIF1α的保守結(jié)合位點(diǎn)，但是我們的結(jié)果表明HIF1α也參與了缺氧條件下Ngb基因的表達(dá)上調(diào)。因此，從這些結(jié)果中我們得出結(jié)論：轉(zhuǎn)錄因子NFκB，Egr1，Sp1通過(guò)與小鼠Ngb基因啟動(dòng)子特異性的結(jié)合參與了對(duì)Ngb基因的調(diào)控，而NFκB，Sp1以及HIF1α參與了缺氧條件下小鼠Ngb基因的調(diào)控。
　　 第二部分

4、：以Neuroglobin為靶分子篩選神經(jīng)保護(hù)藥物研究
　　 中風(fēng)是引起人類(lèi)死亡的主要疾病之一。以前的研究表明Ngb是一個(gè)能保護(hù)神經(jīng)免受缺血缺氧，氧壓以及神經(jīng)退行性病變的新的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)蛋白。因此，上調(diào)Ngb的表達(dá)可能能作為一種干預(yù)和治療中風(fēng)以及相關(guān)性疾病的潛在的治療方法。為了篩選能夠上調(diào)Ngb表達(dá)的自然化合物，我們分別克隆了人以及小鼠約2kb的Ngb啟動(dòng)子并構(gòu)建進(jìn)入報(bào)告基因載體，然后進(jìn)一步分別建立了人以及小鼠具有Ngb啟動(dòng)子

5、報(bào)告基因的穩(wěn)定表達(dá)系。為了鑒定我們的人以及小鼠的穩(wěn)定表達(dá)系，我們初步篩選了一個(gè)包含約40個(gè)化合物的文庫(kù)。我們發(fā)現(xiàn)：Polydatin，Icariin，Genipin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在小鼠的穩(wěn)定表達(dá)系中上調(diào)小鼠的Ngb基因啟動(dòng)子活性。而Polydatin，Genistein，Daidzein，BiochaninA，F(xiàn)ormononetin能夠在人的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中上

6、調(diào)人的Ngb基因啟動(dòng)子活性。通過(guò)RT-PCR和Western blotting我們進(jìn)一步確認(rèn)了Polydatin，Genistein，F(xiàn)ormononetin能夠顯著的上調(diào)NgbmRNA水平和蛋白水平。而且我們的結(jié)果表明Polydatin和Formononetin能夠減少OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元的死亡。因此，我們的結(jié)果說(shuō)明Polydatin和Formononetin可能可以作為潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物，并且我們構(gòu)建的人和小鼠Ngb基因報(bào)告基因表達(dá)系