兒童特應(yīng)性皮炎體液中microRNAs表達的相關(guān)性研究.pdf

1、前言
　　特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis，AD)，是一種較為常見的慢性炎癥性皮膚疾病。特應(yīng)性皮炎的病因與發(fā)病機制還不是很清楚，目前的研究認(rèn)為可能是遺傳因素，免疫因素與環(huán)境因素相互作用并通過免疫途徑介導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果。特應(yīng)性皮炎多數(shù)在嬰幼兒發(fā)病，典型分部的皮損和嚴(yán)重的瘙癢為本病的主要臨床特點。
　　特應(yīng)性皮炎的臨床診斷主要依靠患者的病史和臨床表現(xiàn)，目前常用的國際診斷標(biāo)準(zhǔn)為Hanifin和Rajka制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)和Wi

2、llams診斷標(biāo)準(zhǔn)。SCORAD評分被用來評估疾病臨床的嚴(yán)重程度。但SCORAD評分具有一定的主觀性，主要依靠患者和醫(yī)生的主觀印象，因此在臨床調(diào)查研究中，常需要兩名皮膚科醫(yī)生對患者進行評估。特應(yīng)性皮炎患者的實驗室檢查無特異性，大多數(shù)患者的IgE水平和嗜酸性粒細(xì)胞均有不同程度的升高。研究證明，對AD兒童外用含有神經(jīng)酰胺的保濕乳液，可以恢復(fù)患兒的皮膚屏障功能，緩解瘙癢。早期合理的防護可以增加皮膚含水量并維持皮膚屏障功能在最佳生理水平的最有效

3、方法之一。因此，對于AD的早期診斷，并給予皮膚的保濕防護，可以有效控制疾病的發(fā)展，改善臨床癥狀，提高患兒的生活質(zhì)量。
　　MiRNAs（microRNAs）是一類長度約為22-25nt大小的非編碼RNA分子，由一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長度為70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)剪切后生成。miRNAs通過RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)復(fù)合體和靶mRNA互補結(jié)合，抑制蛋白表達或促進蛋白降解

4、。研究表明，miRNAs參與基因表達、細(xì)胞周期調(diào)控、和個體發(fā)育等多方面調(diào)控，而且，miRNAs在很多疾病中也有異常表達。miRNAs的異常表達和突變最多見于與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。目前越來越多的研究表明，miRNAs和炎癥性疾病如銀屑病，和哮喘具有一定的相關(guān)性。而且，miRNAs在皮膚中的表達具有特征性，如miRNA-200家族（如miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-149），和m

5、iRNA-19、miRNA-20家族（如miRNA-19b、miRNA-20、miRNA-17-5p和miRNA-93）在表皮中優(yōu)先表達，而miRNA-199家族(如miRNA-199a和miRNA-199b)僅在毛囊中表達。miRNA-203是皮膚特異性miRNAs，在皮膚中高水平表達，和表皮分化有關(guān)。這些研究表明miRNAs與皮膚疾病之間有著密不可分的關(guān)聯(lián)。
　　miRNAs在特應(yīng)性疾病的發(fā)病中也起著重要的作用。miR-155

6、在AD患者的皮損處皮膚表達升高，其主要作用是增加了T細(xì)胞的增殖性應(yīng)答引發(fā)皮膚慢性炎癥。這一過程是通過抑制CTLA-4來實現(xiàn)的，CTLA-4是T細(xì)胞活化的主要抑制劑，同時，CTLA-4也是miR-155的靶基因，AD患者的皮損處皮膚miR-155表達升高，抑制了CTLA-4的活性，因此，T細(xì)胞活化增強，T細(xì)胞的反應(yīng)增殖性增強，引發(fā)皮膚慢性炎癥。哮喘是AD的常見伴隨癥狀，miR-126與哮喘的發(fā)病有關(guān)。miR-126表達升高可以誘發(fā)哮喘，抑

7、制miR-126可以抑制IL-4介導(dǎo)的呼吸道炎癥，從而抑制Th2介導(dǎo)的過敏性哮喘。
　　人體各種組織中均有miRNAs的表達，如肝臟、心臟、肺等，而且，miRNAs在不同組織器官中的表達變化，對疾病的潛在信息有重要意義。miRNAs不僅在各種組織中穩(wěn)定的表達，在血清中也有相當(dāng)?shù)臄?shù)量的miRNAs存在，而且其表達相當(dāng)穩(wěn)定。通過測序?qū)ρ逯兄饕男『怂崞芜M行測序分析可以清晰的鑒別出miRNAs和其他小RNA，如rRNAs，或者降解的

8、RNA片段，分析顯示血清中存在有相當(dāng)數(shù)量的不同來源的小RNA，長度在21-23nt，和miRNAs的長度一致。研究表明血清中的小RNA片段中包含豐富的miRNA，而且正常人的血清和血細(xì)胞中miRNAs的表達基本一致，和來自相同個體的血細(xì)胞比較，血清含有一個相對低水平的miRNA。且研究指出miRNAs不易被RNA酶裂解，是穩(wěn)定存在的。在經(jīng)過各種苛刻的條件處理后，包括煮沸，過于酸性或過于堿性，長時間儲存，多次凍融等，血清miRNAs的穩(wěn)定

9、性尚好。RT-PCR分析，未經(jīng)過任何處理的血清miRNA與經(jīng)過各種苛刻條件處理后的血清miRNAs無顯著性差異。大部分的miRNA在男性和女性受試者中的表達水平?jīng)]有明顯差異。至于血清中miRNAs的來源目前還不是很清楚。在疾病過程中，血清miRNA不僅來源于血細(xì)胞循環(huán)，也來源于其他受疾病影響的組織。因此，基于miRNAs的這些特性，這些與疾病相關(guān)的異常表達的特異性血清miRNA可以作為疾病潛在的生物標(biāo)識物。除了血清，miRNAs也穩(wěn)定存

10、在于其他的體液中，如尿液、眼淚、羊水等。miRNA與特應(yīng)性疾病的相關(guān)性研究尚少，尤其是體液miRNA在兒童AD患者中的表達情況目前國內(nèi)尚無這方面的研究報道。本實驗主要擬研究miRNA在中國兒童AD患者體液中的表達情況，以探討特異性miRNA在AD發(fā)病過程可能介導(dǎo)的發(fā)病機制，為兒童AD的診斷尋找新的生物標(biāo)識物。
　　材料和方法
　　一、研究對象
　　1、實驗組兒童AD患者30例，均符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)。男22例，

11、女8例，年齡范圍在6個月至6歲，平均年齡1.9±0.32歲。入選患者均為中國漢族，均處于疾病的急性期，并采用SCORAD評分標(biāo)準(zhǔn)評估疾病的嚴(yán)重程度。所有患者就診前3個月未接收系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素治療，及其他免疫抑制劑治療。
　　2、對照組兒童28例，來自兒外科的患者，受試者主要為血管瘤，隱睪等非系統(tǒng)性疾病，無濕疹病史。男24例，女4例，年齡范圍在6個月至6歲，平均年齡2.1±0.16歲。所有入選受試者均為中國漢族，血清IgE水平均處于

12、正常水平，均排除過敏性鼻炎、哮喘等過敏性疾病及其他系統(tǒng)性疾病。
　　樣品處理:每個受試者收集外周血2ml，尿液5ml，2小時內(nèi)以2500g/min離心10分鐘。分離血清及血細(xì)胞，尿液上清及尿沉渣。血清和尿液上清分裝置于-80℃深凍冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　實驗組及對照組所有受試者年齡、性別均具有可比性，并已排除精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾患，并告知其家屬，由家長簽訂知情同意書。
　　二、實驗材料
　　氯仿、無水乙醇、Qiagenm

13、iRNeasyMinikit、ABI公司TaqManMiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MegaplexRT引物、MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、PreAmpMasterMix、PreAmp引物、蒸餾水、TE液、enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kit、RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArraysV&5.1。
　　三、實驗方法
　　1、應(yīng)用TaqMan

14、低密度芯片(TaqManLowDensityArray(TLDA)HumanmicroRNAPanelversion1.0)實驗方法，尋找差異性表達miRNAs。
　　2、應(yīng)用Real-timePCR方法對芯片鑒定的差異性表達miRNAs進行驗證。
　　3、應(yīng)用ELISA方法檢測SOCS3和STAT3在血清中的表達情況。
　　4、應(yīng)用蛋白抗體芯片(RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArrays

15、V&5.1)實驗方法，鑒定差異性表達的炎癥因子。
　　四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　統(tǒng)計方法主要為t檢驗、單因素方差分析、Pearson's相關(guān)性研究等，取P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SPSS18.0和GraphPadPrism5Project。
　　結(jié)果
　　1、兒童AD體液中miRNAs的表達情況
　　(1)所有受試者的血清和尿液中且均檢測到miRNAs的表達，miRNAs穩(wěn)定的表達在兒童的體液中

16、。
　　(2)兒童AD的血清和尿液中miRNAs的表達都具有特異性，二者均檢測出差異性表達的miRNAs。兒童AD血清檢測到10種差異性表達的miRNAs，其中9種miRNAs表達升高，1種miRNAs表達下降。兒童AD尿液中檢測出17種差異性表達的miRNAs，其中10種miRNAs表達升高，7種miRNAs表達下降。
　　(3)血清和尿液中miRNAs表達具有一致性，在兒童AD的血清和尿液中均檢測到miR-203、miR

17、-483-5p和miR-205的存在。其中miR-203在血清中表達升高，而在尿液中表達降低;miR-483-5p和miR-205在血清中表達升高，在尿液中表達也是升高的。
　　(4)Real-timePCR驗證后得出，和對照組相比，兒童AD血清中miR-203和miR-483-5p表達升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-483-5p與家族異位史有關(guān)，家族其他人伴有異位史的患者比個人伴有異位史的患者血清miR-483-5p的表達升高的更

18、為顯著。miR-203和miR-483-5p的表達和臨床SCORAD評分具有正相關(guān)的趨勢，但P值未達到統(tǒng)計學(xué)意義。尿液中miR-203表達降低且具有統(tǒng)計學(xué)意義。miRNAs的表達和患者的性別年齡無顯著相關(guān)性。
　　2、SOCS3和STAT3在兒童AD血清中的表達情況
　　(1)兒童AD的血清SOCS3水平和對照組相比顯著升高，兒童AD的血清STAT3水平和對照組相比也顯著升高，且均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)兒童AD的

19、血清SOCS3水平與miR-203和miR-483-5p的表達具有相反的表達趨勢，雖然分析顯示P值未達到統(tǒng)計學(xué)意義，但對臨床具有重大意義。
　　(3)兒童AD的血清STAT3水平和臨床SCORAD評分成正相關(guān)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。STAT3和SOCS3無明顯相關(guān)性。
　　3、兒童AD血清中炎癥相關(guān)蛋白的表達情況
　　(1)兒童AD血清中MIP-1β、sTNFRI、ICAM-1、sTNFRⅡ和MCP-1水平顯著升高;IL-

20、6sR和TIMP-2水平顯著降低。
　　(2)TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1，3種炎癥因子和臨床SCORAD評分成正相關(guān)，sTNFRⅠ和sTNFRⅡ分別與miR-203成正相關(guān)。ICAM-1和SOCS3成負(fù)相關(guān)。
　　(3)兒童AD血清中異常表達的七種炎癥因子MIP-1β，sTNFRⅠ，ICAM-1，IL-6sR，TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1在AD的發(fā)病過程中可能參與了效應(yīng)細(xì)胞凋亡、Th2細(xì)胞應(yīng)答、炎性細(xì)胞

21、浸潤，及瘙癢信號等調(diào)節(jié)作用，并和SOCS3/STAT3通路有關(guān)。
　　結(jié)論
　　1、miRNAs穩(wěn)定的表達在兒童的體液中，包括血清和尿液。
　　2、兒童AD的血清和尿液中均具有特異性的miRNAs表達模式。兒童AD血清中miR-203和miR-483-5p表達升高，尿液中miR-203表達降低。血清miR-203和miR-483-5p的表達和疾病的臨床嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。
　　3、兒童AD的血清和尿液在具有各自