4-1BB和CD40信號(hào)對(duì)TLR4表達(dá)調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、Toll樣受體(TLR)是固有性免疫應(yīng)答中的重要成分，不但在感染性免疫中發(fā)揮重要作用，而且參與了腫瘤的免疫應(yīng)答和免疫逃逸過程，TLR家族中受到廣泛關(guān)注的是TLR4分子。樹突狀細(xì)胞(DC)作為機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在對(duì)多種疾病應(yīng)答中，尤其是在對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答中發(fā)揮了不可替代的作用。已有研究表明多種因素可以影響單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞上TLR4的表達(dá)，但共刺激分子CD40和4-1BB對(duì)TLR4表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。本研究旨在通過激活DC或單核細(xì)

2、胞上CD40或4-1BB分子后，觀察TLR4分子表達(dá)的變化，以期為腫瘤免疫治療提供新的方法與思路。 1．4-1BB信號(hào)對(duì)小鼠樹突狀細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié) 目的：探討激發(fā)型小鼠4．1BB(CDl37)單克隆抗體2A對(duì)小鼠骨髓來源未成熟DC(imDC)及樹突狀細(xì)胞株DC2．4表面TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)。方法：在imDC中加入不同劑量2A(聯(lián)合兔抗大鼠IgG-Fc段抗體，CL)、LPS、2A(+CL)與LPS聯(lián)合后作用6h，流式細(xì)

3、胞術(shù)(FCM)檢測(cè)TLR4表達(dá)；或在以上處理因素作用后不同時(shí)相(0h、3h、6h、12h、24h)，以及先用LPS刺激imDC6h再加入2A(+CL)作用6h后，以FCM檢測(cè)imDC表面TLR4表達(dá)。結(jié)果：LPS可下調(diào)imDC上TLR4的表達(dá)，作用可維持24h。單獨(dú)使用2A無明顯效應(yīng)，但與CL聯(lián)合后2A可使imDC上調(diào)TLR4分子的表達(dá)，作用可維持12h。2A(+CL)與LPS聯(lián)合作用仍可使imDC上調(diào)表達(dá)TLR4分子。先用LPS預(yù)處理

4、imDC6h再加入2A作用6h，2A仍可拮抗LPS的下調(diào)作用。在樹突狀細(xì)胞株DC2．4細(xì)胞表面也得到相似的結(jié)果。結(jié)論：4—1BB信號(hào)可上調(diào)小鼠骨髓來源未成熟DC和樹突狀細(xì)胞株DC2．4表面TLR4的表達(dá)，上調(diào)效應(yīng)具有時(shí)間和劑量依賴性，并可拮抗LPS介導(dǎo)的TLR4下調(diào)效應(yīng)。 2．CI)40信號(hào)對(duì)人單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié) 目的：探討人激發(fā)型CD40單克隆抗體5C11對(duì)人單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)。

5、方法：外周血單個(gè)核細(xì)胞貼壁后可獲取單核細(xì)胞，在GM-CSF和IL-4作用下單核細(xì)胞向DC分化發(fā)育。不同刺激物(rhlL-2、rhlL-4、5C1l、羊抗小鼠IgG-Fc段抗體(CL)、5C1HCL、5C11+CL+rhlL-2、5C11+CL+rhIL-4)作用于單核細(xì)胞24h后以FCM檢測(cè)TLR4表達(dá)：5C11和／或CL作用于單核細(xì)胞后的不同時(shí)相(Oh、2h、4h、24h)，以及單核細(xì)胞向未成熟DC分化發(fā)育過程中FCM檢測(cè)TLR4的表

6、達(dá)；FCM檢測(cè)各種不同刺激物(LPS、TNF-ot、5C11、CL、5C1HCL)作用于未成熟DC24或48h后TLR4的表達(dá)，并用RT-PCR方法檢測(cè)5C11和／或CL刺激未成熟DC48h后TLR4表達(dá)水平。結(jié)果：新鮮分離的單核細(xì)胞表達(dá)高水平TLR4，培養(yǎng)24h后表達(dá)迅速下降，聯(lián)合使用5C11與CL后可以有效拮抗這一過程，使TLR4表達(dá)維持在中等水平，單獨(dú)加入rhIL-2、rhIL-4、5C1l或CL未能影響TLR4表達(dá)。單核細(xì)胞向未

7、成熟DC分化發(fā)育過程中，TLR4呈極低水平表達(dá)。LPS、TNF-α、5C11、CL或聯(lián)合使用5C¨與CE作用于未成熟DC24或48h后，僅聯(lián)合使用組可顯著促進(jìn)TLR4表達(dá)，且蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平一致。結(jié)論：CD40信號(hào)可以維持人單核細(xì)胞上TLR4的表達(dá)，并促進(jìn)人成熟樹突狀細(xì)胞表達(dá)TLR4分子。 本實(shí)驗(yàn)中都使用了IgG-Fc段抗體作為交聯(lián)劑以提高4-1BB信號(hào)和CD40信號(hào)強(qiáng)度，促進(jìn)單核細(xì)胞和DC表達(dá)TLR4分子。近年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)表達(dá)