HIC1甲基化調(diào)控HIC1-SIRT1通路在慢性胰腺炎惡性轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、背景及目的:慢性胰腺炎是胰腺癌發(fā)生的高危因素,慢性炎癥組織微環(huán)境改變可以誘導(dǎo)基因表觀遺傳學(xué)改變。前期研究發(fā)現(xiàn) SIRT1可以促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生,但是對(duì)其調(diào)控機(jī)制尚未深入研究。本研究旨在探討 HIC1基因啟動(dòng)子甲基化及HIC1/SIRT1表達(dá)在慢性胰腺炎及胰腺癌發(fā)生中的作用。
　　研究方法:應(yīng)用甲基化特異性 PCR檢測(cè)正常胰腺組織、慢性胰腺炎組織及胰腺癌組織中HIC1啟動(dòng)子 CpG島的甲基化水平,比較 HIC1甲基化與胰腺癌臨床病理學(xué)

2、特征之間的關(guān)系;用免疫組織化學(xué)染色及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè)臨床標(biāo)本中HIC1蛋白及SIRT1蛋白的表達(dá),比較 HIC1和SIRT1表達(dá)的相關(guān)性。檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞系 PANC-1、BXPC-3、ASPC-1中HIC1基因啟動(dòng)子甲基化水平。通過(guò)去甲基化試劑5-aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞系,誘導(dǎo) HIC1基因啟動(dòng)子去甲基化。利用western blot檢測(cè)5-aza-dC處理后胰腺癌細(xì)胞系中HIC1及SIRT1蛋白表達(dá)情況,同時(shí)用MTT法繪

3、制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,β半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老狀態(tài),流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的及細(xì)胞凋亡的改變。在 PANC-1細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagHIC1真核表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò) G418篩選構(gòu)建 HIC1高表達(dá)的PANC-1細(xì)胞。應(yīng)用western blot檢測(cè) HIC1蛋白高表達(dá)對(duì) SIRT1表達(dá)的影響,以及對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡及衰老的作用。此外,在 HIC1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞中,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1再次

4、上調(diào) SIRT1的表達(dá),觀察對(duì)細(xì)胞增殖、周期、凋亡及衰老的調(diào)控作用。為了初步探討 HIC1/SIRT1對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響的分子機(jī)制,在5-aza-dC處理的PANC-1、BXPC-3、ASPC-1細(xì)胞中和利用外源性基因表達(dá)調(diào)控 HIC1/SIRT1通路的PANC-1細(xì)胞中,用western blot法檢測(cè)乙酰化 P53、總 P53、p21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:HIC1啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率在正常胰腺組織、慢

5、性胰腺炎組織及胰腺癌組織中分別為11.4％、47.5％、79.3％,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示 HIC1啟動(dòng)子甲基化水平在慢性胰腺炎和胰腺癌組織中逐漸增加(P<0.01)。HIC1啟動(dòng)子甲基化水平與患者的年齡、腫瘤 TNM分期相關(guān)(P<0.01),與腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示 HIC1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表達(dá)陽(yáng)性率分別為91.4％,62.5％,37.5％,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示 HIC1蛋白表達(dá)在慢性胰腺炎和胰

6、腺癌組織中逐漸下降(P<0.01)。SIRT1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表達(dá)分別為48.6％,80％,92.2％,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示 SIRT1在慢性胰腺炎及胰腺癌中表達(dá)明顯高于正常胰腺組織(P<0.001)。在 HIC1甲基化陽(yáng)性的胰腺組織樣本中,HIC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于 HIC1甲基化陰性組(P<0.001)。HIC1蛋白表達(dá)與患者的年齡、腫瘤 TNM分期相關(guān)(P<0.01),與腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。實(shí)

7、時(shí)熒光定量PCR證實(shí)胰腺組織樣本中HIC1和SIRT1 mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平一致。胰腺癌細(xì)胞系 PANC-1、BXPC-3以及ASPC-1中均存在 HIC1啟動(dòng)子甲基化和HIC1蛋白表達(dá)缺失。5-aza-dC干預(yù)可逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞中HIC1的甲基化狀態(tài),恢復(fù) HIC1蛋白表達(dá)的同時(shí)下調(diào) SIRT1的蛋白表達(dá)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理后細(xì)胞增殖明顯減緩。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞系后三株細(xì)胞均出現(xiàn)明

8、顯的G1期阻滯,并可以誘導(dǎo) PANC-1細(xì)胞凋亡。β半乳糖苷酶染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5-aza-dC干預(yù)后在3株胰腺癌細(xì)胞中均出現(xiàn)衰老比例增加。真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3FlagHIC1轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后,通過(guò) G418篩選獲得 HIC1穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在該細(xì)胞中SIRT1表達(dá)明顯下降。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細(xì)胞相對(duì)野生型PANC-1細(xì)胞增殖速度明顯減慢,β半乳糖苷酶染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)衰老細(xì)胞比例

9、明顯增加(16.3±3.1％ vs56.6±5.5％)。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞出現(xiàn) G1期停滯(55.3±2.5％ vs70.6±2.3％),凋亡比例增加(2.7±0.5％ vs13.4±1.1％)。在穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1可以再次上調(diào) SIRT1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞的衰老、緩解 G1期阻滯,但對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。5-aza-dC干預(yù)三株胰腺癌細(xì)胞可以誘導(dǎo) p21WAF1

10、/CIP1表達(dá)上調(diào),但對(duì)總 P53和乙?；?P53蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響;穩(wěn)轉(zhuǎn) HIC1的PANC-1細(xì)胞相對(duì)于野生型 PANC-1細(xì)胞乙?；?P53比例增加,p21WAF1/CIP1表達(dá)上調(diào)。再次轉(zhuǎn)染 pCDNA3FlagSIRT1后可以部分逆轉(zhuǎn)其表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.HIC1啟動(dòng)子甲基化水平在慢性胰腺炎組織和胰腺癌組織中逐漸增加,與患者年齡、腫瘤 TNM分期密切相關(guān)。HIC1甲基化水平和HIC1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。HIC

11、1和SIRT1胰腺組織中呈排他性表達(dá)趨勢(shì),說(shuō)明胰腺癌組織中HIC1甲基化有可能通過(guò)沉默 HIC1蛋白表達(dá)導(dǎo)致 SIRT1表達(dá)上調(diào),為體外研究 HIC1/SIRT1通路奠定了基礎(chǔ)。
　　2.通過(guò)去甲基化試劑5-aza-dC可以逆轉(zhuǎn)胰腺癌細(xì)胞中HIC1甲基化,下調(diào) SIRT1的表達(dá),并能顯著抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和G1期阻滯。說(shuō)明對(duì) HIC1表觀遺傳學(xué)的調(diào)控可以發(fā)揮抑制胰腺癌生長(zhǎng)的作用。
　　3.成功構(gòu)建 HIC1穩(wěn)轉(zhuǎn) PA

12、NC-1細(xì)胞系,靶向上調(diào) HIC1表達(dá)可以抑制SIRT1表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和G1期阻滯。再次上調(diào) SIRT1可部分逆轉(zhuǎn) HIC1上調(diào)所帶來(lái)的生物學(xué)效應(yīng)。證實(shí)在胰腺癌細(xì)胞中HIC1通過(guò) SIRT1發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　4.5-aza-dC逆轉(zhuǎn) HIC1甲基化和外源性基因調(diào)控 HIC1/SIRT1表達(dá)可以影響乙酰化P53的比例和p21WAF1/CIP1蛋白的表達(dá),說(shuō)明乙?；?P53和P21是 HIC1/SIRT1信號(hào)通路