IL-18對胰腺星狀細(xì)胞CX3CL1表達(dá)的影響及在慢性胰腺炎中的作用.pdf

1、慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是以胰腺組織不可逆纖維化損傷為特征的進(jìn)展性炎性疾病，損傷導(dǎo)致胰腺內(nèi)、外分泌功能受損，進(jìn)而出現(xiàn)糖尿病、脂肪瀉等臨床病癥[1,2]。CP有多種病因，飲酒被廣泛認(rèn)為是急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)和CP的主要病因[1，2]。
　　胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PSCs)存在于正常的胰腺組織中且一般處于靜息狀態(tài)，在其胞質(zhì)

2、內(nèi)儲存含維生素A豐富的脂滴;但是，當(dāng)胰腺受到炎癥或者外傷時，靜息狀態(tài)的PSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谐杉±w維細(xì)胞樣表型特征的活化狀態(tài)，且α平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)表達(dá)增加[3]。因此，激活的PSCs可能通過分泌一些細(xì)胞因子或趨化因子（如轉(zhuǎn)化生長因子β15），以及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成份(extracellular matrix components，ECM)，如I型膠原和纖連蛋白等，在CP發(fā)病機制中

3、發(fā)揮中心作用[4,5]。
　　目前關(guān)于PSCs和CP纖維化之間關(guān)系的研究有很多，但關(guān)于IL-18、趨化因子CX3CL1與PSCs之間關(guān)系以及在CP中作用機制研究相對較少，本實驗主要研究CP大鼠和正常大鼠PSCs活化情況和CX3CL1表達(dá)情況;以及利用不同濃度IL-18孵育PSCs，了解IL-18對PSCs的作用;并進(jìn)一步探索IL-18激活PSCs的相關(guān)信號通路，探索其發(fā)生的機制。
　　第一部分:慢性胰腺炎大鼠胰腺星狀細(xì)胞IL

4、-18、CX3CL1、α-SMA表達(dá)情況
　　研究目的:探索慢性胰腺炎大鼠胰腺發(fā)生纖維化后胰腺星狀細(xì)胞激活情況，以及IL-18、趨化因子CX3CL1、α-SMA表達(dá)情況。
　　研究方法:正常Wistar雄性大鼠(體重180-200g)，通過尾靜脈注射DBTC(8mg/Kg)方法造成慢性胰腺炎模型，胰腺組織通過HE染色判斷胰腺纖維化發(fā)生情況。通過消化法-梯度離心的方法提取出原代胰腺星狀細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)4天后，收集細(xì)胞，再提取細(xì)胞

5、總RNA，通過RT-PCR方法檢測IL-18、CX3CL1、α-SMA mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果:RT-PCR法檢測對照組PSCs IL-18 mRNA表達(dá)量為1.01±0.08，造模組PSCs IL-18 mRNA相對表達(dá)量為1.73±0.40，造模組PSCs IL-18 mRNA表達(dá)量高于對照組，造模組和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。對照組PSCs CX3CL1表達(dá)量為1.07±0.26，造模組PSCs CX

6、3CL1 mRNA相對表達(dá)量為2.22±0.13，造模組PSCs CX3CL1 mRNA表達(dá)量高于對照組，造模組和對照組PSCs CX3CL1 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.96，P＜0.05)。對照組PSCsα-SMA mRNA表達(dá)量為1.00±0.05，造模組PSCsα-SMA mRNA相對表達(dá)量為9.76±0.28，造模組PSCsα-SMAmRNA表達(dá)量高于對照組，造模組和對照組PSCsα-SMA mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)

7、意義(t=30.78，P＜0.01)。
　　結(jié)論:胰腺發(fā)生纖維化后胰腺星狀細(xì)胞發(fā)生激活，主要變現(xiàn)為α-SMA表達(dá)上調(diào);且胰腺發(fā)生纖維化后趨化因子CX3CL1的表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分:IL-18對胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)及趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響
　　研究目的:探討不同濃度梯度IL-18對胰腺星狀細(xì)胞活化狀態(tài)的影響，以及對趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響。
　　研究方法:人胰腺星狀細(xì)胞株在星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳

8、代，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板，每孔5×105個細(xì)胞，培養(yǎng)后待細(xì)胞融合度達(dá)到80％后向各孔中分別加入不同濃度梯度的IL-18(5、25、50、100ng/ml)，觀察72小時后收集細(xì)胞，以未處理組為對照組，利用RT-PCR和Western Blot檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1mRNA和蛋白表達(dá)情況，觀察IL-18是否能激活人PSCs;以及觀察IL-18能否上調(diào)PSCs中趨化因子CX3CL1表達(dá)。
　　結(jié)果:

9、對照組、5、25、50、100ng/ml IL-18處理組PSCs的E-cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06;α-SMA mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09; CX3CL1 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1

10、.58±0.26、1.83±0.13。相對于對照組，處理組E-cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào)，α-SMA及CX3CL1 mRNA表達(dá)上調(diào)，其中100ng/ml處理組與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＜0.05）。對照組、5、25、50、100ng/ml IL-18處理組PSCs的E-cadherin蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06;α-SMA蛋白表達(dá)

11、量分別為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02; CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。處理組E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，但各組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，IL-1825ng/ml處理組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);IL-1850ng/ml處理組和對照

12、組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);IL-18100ng/ml處理組和對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值＜0.01);CX3CL1蛋白表達(dá)上調(diào)，其中IL-18100ng/ml處理組與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P值＜0.05)。
　　結(jié)論:IL-18能激活人胰腺星狀細(xì)胞，表現(xiàn)為α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào);且IL-18能上調(diào)趨化因子CX3CL1的表達(dá)。
　　第三部分:PDTC能否緩解IL-

13、18引起的胰腺星狀細(xì)胞激活及CX3CL1表達(dá)上調(diào)
　　研究目的:驗證NF-κB途徑抑制劑PDTC能否緩解IL-18引起的胰腺星狀細(xì)胞激活及趨化因子CX3CL1表達(dá)上調(diào)。
　　研究方法:人胰腺星狀細(xì)胞株在星狀細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于六孔板，每孔5×105個細(xì)胞，待各孔細(xì)胞融合度達(dá)到80％以后加藥。實驗分為4各組，PDTC處理組（10μmol/L、30μmol/L）、IL-18處理組、正常對照組。利用RT-

14、PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測法檢測E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:對照組、IL-18處理組、PDTC(10μmol/L)+ IL-18處理組、PDTC(30μmol/L)+ IL-18處理組E-cadherin mRNA表達(dá)量為1.01±0.08，0.47±0.03，0.51±0.11，0.90±0.10，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.64，P＜0.01);各組α-SMA mRNA

15、表達(dá)量分別為1.02±0.16，4.22±0.57，4.05±0.44，1.82±0.17，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.88，P＜0.01);各組CX3CL1 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.12，2.38±0.19，2.51±0.19，1.37±0.13，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.62，P＜0.01)。PDTC（10μmol/L、30μmol/L）+IL-18處理組與IL-18處理組相比，E-cadherin mRNA表達(dá)

16、上調(diào)，α-SMA、CX3CL1 mRNA表達(dá)下調(diào)，差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義。對照組、IL-18處理組、PDTC(10μmol/L)+ IL-18處理組、PDTC(30μmol/L)+ IL-18處理組E-cadherin蛋白表達(dá)量為1.03±0.08，0.40±0.02，0.49±0.09，1.09±0.04，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.04，P＜0.01);各組α-SMA蛋白表達(dá)量分別為1.07±0.08，1.87±0.21，1.92

17、±0.21，1.34±0.08，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.82，P＜0.05);各組CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.02±0.04，1.38±0.14，1.61±0.08，1.28±0.04，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.01，P＜0.01)。PDTC(30μmol/L)+IL-18處理組與IL-18處理組相比，E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)且表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，α-SMA和CX3CL1蛋白表達(dá)下調(diào)且表達(dá)差異沒有