家族性肥厚型心肌病相關(guān)cTnI基因突變檢測芯片的制備及應(yīng)用.pdf

1、基因芯片,又稱DNA微陣列,是由固定于固相載體表面的核苷酸探針陣列所構(gòu)成的一種新型微型器件.它基于核酸分子雜交的原理,可直接、平行的得到大量的核酸序列信息.基因芯片以其高通量、高信息量、且自動化程度高的特點成為檢測基因突變的最佳方法之一.肥厚型心肌病(HCM)是一種以心肌非對稱性肥厚為特征的原發(fā)性心肌病,是遺傳異質(zhì)性疾病,屬常染色體顯性遺傳,約55％以上的患者有家族史.HCM是一種常見的心肌病,會使健康青年猝死,是危害人類健康的主要疾病

2、之一.該課題針對心肌肌鈣蛋白I(Cardiac troponin I,cTnI)基因上4個外顯子的突變進行了一系列基于基因芯片原理和技術(shù)的系統(tǒng)實驗研究,這四個外顯子的突變與家族性肥厚型心肌病(Family Hypertrophic Cardiomyopathy,FHCM)的發(fā)生密切相關(guān).最終目的旨在開發(fā)高靈敏度、高特異性的家族性肥厚型心肌病相關(guān)cTnI基因突變檢測芯片.為此,該文對有關(guān)基因芯片的制作進行了初步的研究,并制備了cTnI基因

3、突變檢測芯片,取得了較為滿意的結(jié)果.我們首先參照文獻設(shè)計了能特異擴增靶序列的引物,并對從新鮮血液中提取出的DNA進行PCR擴增,摸索并優(yōu)化了PCR擴增的反應(yīng)體系與退火溫度、循環(huán)次數(shù)等擴增條件.為了使操作簡化,隨后我們探索了多重PCR擴增技術(shù),實現(xiàn)了對該基因上4條外顯子的二重或三重PCR擴增.實驗結(jié)果表明:Mg<'2+>離子濃度對多重擴增效果影響很大,較低的Mg<'2+>濃度有利于提高特異性.此外,在相同條件下,適當(dāng)高的退火溫度可以增加擴

4、增的特異性,在我們的實驗體系中,退火溫度為64℃時擴增的特異性最佳.為了制作基因芯片,我們針對外顯子上的突變特征設(shè)計了特異性探針,制備了可以同時對cTnI基因上四條外顯子的突變進行檢測的集成式芯片.并通過與擴增得到的靶序列進行雜交,系統(tǒng)摸索并優(yōu)化了雜交溫度、雜交時間等雜交條件對雜交結(jié)果的影響,取得了較好的特異性雜交/非特異雜交信號強度比.將該芯片應(yīng)用于遺傳性肥厚性心肌病相關(guān)基因突變的分析,結(jié)果表明,該芯片檢測突變正錯配區(qū)別明顯(正中堿基