炎癥因子上調(diào)SREBP-1致小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)異常聚集及損傷.pdf

1、本文從以下幾方面進(jìn)行了詳細(xì)闡述。
　　第一部分小鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。
　　目的:肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官，建立小鼠原代肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)，用于后續(xù)脂代謝研究。
　　方法:采用Ⅳ型膠原酶原位二步灌流法分離小鼠原代肝細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)試劑對(duì)新鮮分離的細(xì)胞進(jìn)行染色以檢測(cè)細(xì)胞活率，并在不同時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況和培養(yǎng)基中白蛋白的分泌情況。通過對(duì)肝細(xì)胞白蛋白進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色和糖原染色，完成對(duì)肝細(xì)胞的鑒定。
　　結(jié)果

2、:臺(tái)盼藍(lán)結(jié)果顯示:本法所制得的小鼠原代肝細(xì)胞活率最高可達(dá)90％。剛分離的肝細(xì)胞大多數(shù)呈單個(gè)球形，具有一定立體感。4小時(shí)后肝細(xì)胞已基本貼壁，可見肝細(xì)胞的典型的雙核結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)呈扁平狀。1天后雙核更加明顯，核仁清晰可見，胞質(zhì)貼壁更加扁平，2天后細(xì)胞成多邊形，并維持此形態(tài)數(shù)天。免疫細(xì)胞化學(xué)染色和糖原染色顯示，所培養(yǎng)細(xì)胞基本均可合成白蛋白和糖原，并且一周以內(nèi)都可以在培養(yǎng)基中檢測(cè)到細(xì)胞分泌的白蛋白。
　　結(jié)論:小鼠原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)技術(shù)建

3、立成功，在一周內(nèi)具有較好的形態(tài)和功能，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分炎癥因子對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚及損傷的影響。
　　目的:近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，慢性系統(tǒng)性炎癥在代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展中有十分重要的作用。我們通過建立原代肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)技術(shù)，在體外模擬肝細(xì)胞正常生理狀態(tài)，探討炎癥因子是否能造成小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)的聚集及損害。
　　方法:將培養(yǎng)的小鼠原代肝細(xì)胞分為以下6個(gè)組:Control組、軟脂酸組(PA)組、炎癥因子T

4、NF-α組和IL-6組、PA+TNF-α組和PA+IL-6組。定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和游離脂肪酸水平及油紅O染色法來(lái)觀察各組細(xì)胞的脂質(zhì)沉積情況。熒光定量PCR法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)IRE1，ATF6，GRP78水平。通過測(cè)定過氧化氫以及活性氧水平來(lái)檢測(cè)細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　結(jié)果:給予炎癥因子TNF-α或IL-6炎癥刺激后，小鼠原代肝細(xì)胞的甘油三酯的含量出現(xiàn)了明顯升高;即使在高脂肪酸背景下，炎癥因子同樣也能刺激脂肪酸和甘油三酯的含

5、量。這與肝細(xì)胞的油紅O染色結(jié)果一致。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)IRE1，ATF6，GRP78的基因表達(dá)水平以及氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS和H2O2水平與脂肪酸和甘油三酯含量變化趨勢(shì)基本一致。
　　結(jié)論:炎癥因子可使脂質(zhì)在小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)異常積聚，進(jìn)而還可引起氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而使肝細(xì)胞受損。
　　第三部分炎癥因子對(duì)SREBP-1及其下游靶基因表達(dá)的影響。
　　目的:SREBP-1是一種在肝臟中含量豐富的核轉(zhuǎn)錄因子，主要通

6、過調(diào)控下游靶基因ACCα和FAS的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪酸的合成，影響肝臟內(nèi)甘油三酯的含量。本研究旨在探討炎癥因子對(duì)SREBP-1、ACCα和FAS表達(dá)的影響。
　　方法:按第二部分的方法對(duì)原代肝細(xì)胞進(jìn)行分組。采用熒光定量PCR法檢測(cè)炎癥因子對(duì)小鼠原代肝細(xì)胞中SREBP-1、ACCα和FAS基因水平變化，同時(shí)采用蛋白免疫印跡（Western Blotting）的方法觀察炎癥因子對(duì)小鼠原代細(xì)胞中SREBP-1、ACCα和FAS蛋白表達(dá)情