炎癥干擾FAT-CD36表達并致腎臟脂質(zhì)異常積聚及損傷的實驗研究.pdf

1、第一部分C57BL/6J小鼠炎癥模型的建立
　　目的：研究表明，慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥與脂代謝紊亂密切相關，炎癥通過多種細胞信號通路參與了代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展。在對慢性腎臟疾病患者進行研究時發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)炎癥因子水平出現(xiàn)升高。本實驗采用連續(xù)14周皮下注射10％酪蛋白，從而使C57BL/6J小鼠體內(nèi)產(chǎn)生炎癥，模擬人體內(nèi)慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥，研究炎癥是否干擾FAT/CD36表達并致腎臟脂質(zhì)異常積聚及引起腎臟損傷。
　　方法：8周齡

2、雄性C57 BL/6J小鼠按照喂養(yǎng)方式及處理方式不同隨機分為普通飲食組(NCD)、普通飲食+炎癥組(NCD+Casein)、高脂飲食組(HFD)、高脂飲食+炎癥組(HFD+Casein)。炎癥組小鼠隔日皮下注射1.5ml10％酪蛋白，非炎癥組隔日皮下注射0.5ml生理鹽水；對照組和單純炎癥組喂以普通飲食，高脂及高脂加炎癥組喂以西方飲食(D12492，含35％脂肪，26％蛋白，0.3％膽固醇)。14周后處死小鼠，收集小鼠血清及腎臟組織。E

3、LISA法測定小鼠血清中游離脂肪酸(FFA)，炎癥指標血清淀粉樣蛋白(SAA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。
　　結果：無論是普通飲食還是高脂飲食，注射酪蛋白小鼠血清中炎癥因子SAA及TNF-α與對照組相比水平顯著增加，P<0.05。同時血清FFA檢測結果顯示，注射酪蛋白小鼠血清FFA水平與對照組相比出現(xiàn)升高，差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　結論：運用隔日皮下注射Casein14周的方法，可使C57BL/d6J

4、小鼠體內(nèi)產(chǎn)生慢性低豐度系統(tǒng)性炎癥，并且血清中FFA水平出現(xiàn)升高，本實驗中C57BL/6J小鼠炎癥模型建立成功。
　　第二部分炎癥對腎臟脂質(zhì)及腎細胞異常積聚及損傷的影響
　　目的：觀察在炎癥應激狀態(tài)下，C57BL/d6J小鼠腎臟及HMCs、HK2細胞中脂質(zhì)水平、氧化應激及纖維化等損傷情況，探討炎癥是否可使腎臟及腎細胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積并造成腎臟損害。
　　方法：將人腎系膜細胞(HMCs)及人近曲小管上皮細胞(HK2)分為6組

5、，分別給予無血清培養(yǎng)(對照)、高脂(軟脂酸PA，0.04μmol/ml)、腫瘤壞死因子(TNF-α，25ng/ml)、白介素6(IL-6，20ng/ml)、聯(lián)合干預1(0.04μmol/ml PA+25ngml TNF-α)、聯(lián)合干預2(0.04μmol/mlPA+20ng/ml IL-6)處理。C57BL/6J小鼠分組見第一部分。油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積情況，定量比色法檢測組織與細胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量。ELISA檢測組織與細胞游離脂

6、肪酸(FFA)水平。過氧化氫及活性氧試驗檢測氧化應激水平。天狼星紅及Masson染色檢測腎臟膠原纖維。免疫組織化學法檢測腎臟組織α-SMA蛋白表達水平。檢測C57BL/6J小鼠血清肌酐(Scr)，尿素氮(BUN)。
　　結果：與對照組相比，給予炎癥刺激兩種小鼠血清中FFA水平有增加，血清肌酐亦出現(xiàn)升高。HMCs、HK2及腎臟油紅O染色結果顯示，炎癥處理能明顯增加細胞及腎臟組織內(nèi)脂質(zhì)蓄積。細胞與腎臟組織TG與FFA檢測結果與油紅O染

7、色結果一致。我們進一步體內(nèi)外發(fā)現(xiàn)單純炎癥及高脂處理后過氧化氫及活性氧水平升高，而聯(lián)合干預處理后這一升高作用更為明顯。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)單純炎癥組及高脂組。腎臟膠原纖維輕度增加，而在高脂+炎癥組腎臟組織膠原纖維明顯增加。
　　結論：不管是體內(nèi)還是體外實驗，慢性炎癥均可使脂質(zhì)在腎臟異常積聚。同時，炎癥狀態(tài)還可使腎臟及腎細胞出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，出現(xiàn)早期纖維化，小鼠腎功能受到一定損害。
　　第三部分炎癥狀態(tài)下腎臟和腎細胞FAT/CD36表達

8、情況
　　目的：FAT/CD36是一個廣泛分布于多種組織細胞的膜糖蛋白，屬于清道夫受體家族，是介導細胞攝入脂肪酸的重要蛋白分子。本研究旨在用體內(nèi)外模型觀察炎癥狀態(tài)下腎臟組織和腎細胞FAT/CD36的表達情況。
　　方法：采用實時定量PCR(Real-Time PCR)法檢測炎癥狀態(tài)下小鼠腎臟和HMCs、HK2細胞中FAT/CD36基因水平變化，同時采用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法及免疫組織化學染色方法觀