FAT-CD36缺失對小鼠肝臟胰島素敏感性的影響.pdf

1、目的：人類白細(xì)胞分化抗原36（Cluster of Differentiation,CD36）,又名脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶（Fatty Acid Translocase,FAT）是連接機(jī)體脂肪酸代謝和炎癥發(fā)生的重要膜糖蛋白；同時，它又與機(jī)體的葡萄糖代謝過程緊密相連。大量研究證實(shí)機(jī)體FAT/CD36蛋白的高表達(dá)與非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和胰島素抵抗（Insulin Resi

2、stance，IR）等代謝綜合癥（Metabolic Syndrome,MS）的發(fā)生呈正相關(guān)關(guān)系；同時，有研究發(fā)現(xiàn)FAT/CD36基因缺失也能引起肝臟NAFLD和IR的發(fā)生，但其中具體發(fā)病的分子機(jī)制目前仍然不完全清楚。本研究旨在初步探討FAT/CD36基因缺失在加重肝臟胰島素抵抗發(fā)生中的作用及機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療與FAT/CD36蛋白有關(guān)的IR和2型糖尿?。═ype2 Diabetes Mellitus,T2DM）提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)

3、。
　　方法：
　　第一部分、選取6-8周齡具有C57BL/6J遺傳背景基因的雄性野生型（WT）小鼠作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物模型，分別予以正常飲食飼料（Normal Chow Diet,NCD）和高脂肪酸飲食飼料（High Fatty Diet，HFD）喂養(yǎng)12周。飼養(yǎng)期間，每周稱取小鼠的體重并記錄；在喂養(yǎng)到第10和第11周分別對兩組小鼠進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)（Glucose Tolerance Test,GTT）和胰島素耐量試驗(yàn)（In

4、sulin Tolerance Test,ITT）的檢測，了解機(jī)體對葡萄糖的代謝和對胰島素刺激的敏感性情況。小鼠造模喂養(yǎng)期結(jié)束后麻醉解剖，取小鼠血清和肝臟組織分別做以下試驗(yàn)檢測：血清葡萄糖和胰島素濃度檢測，了解機(jī)體對葡萄糖的代謝和胰島素分泌情況；肝臟組織石蠟切片蘇木精-伊紅（H&E）染色和冰凍切片油紅O（Oil Red O,ORO）染色以及新鮮肝臟組織中甘油三脂（TG）含量的定量檢測，了解肝臟細(xì)胞脂肪變性的嚴(yán)重程度和肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積的情況；

5、蛋白免疫印跡（Western Bloting）技術(shù)檢測肝臟FAT/CD36蛋白表達(dá)的水平，了解HFD能否誘導(dǎo)肝臟FAT/CD36蛋白的異常高表達(dá)；Western-blot技術(shù)檢測肝臟胰島素信號通路相關(guān)蛋白（蛋白激酶B, AKT和磷酸化蛋白激酶B,p-AKT）的表達(dá)水平，了解肝臟胰島素信號通路的活化水平。
　　第二部分、選取6-8周齡具有C57BL/6J遺傳背景基因的雄性野生型（WT）和FAT/CD36基因敲除（CD36-/-）小鼠

6、作為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動物模型，分別予以高脂肪酸飼料（HFD）喂養(yǎng)12周。造模飼養(yǎng)期間，每周稱取兩組小鼠的體重并記錄；喂養(yǎng)結(jié)束后麻醉解剖，取小鼠血清和肝臟組織分別做以下試驗(yàn)檢測：稱取每只小鼠肝臟重量并記錄，計(jì)算肝臟與體重的比值；血清胰島素水平檢測了解機(jī)體胰島素的分泌情況；血清FFA、TG和TC水平檢測，了解機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)的代謝情況；血清TNF-α和IL-6水平檢測，了解機(jī)體全身的炎癥水平；肝臟組織石蠟切片的H&E染色和冰凍切片的ORO染色以及新鮮肝臟

7、組織中TG含量的定量檢測，了解肝臟細(xì)胞脂肪變性程度和肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況；實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)分別檢測炎癥因子（TNF-α；IL-6和IL-1β）和巨噬細(xì)胞趨化因子（巨噬細(xì)胞趨化蛋白1，MCP-1；巨噬細(xì)胞炎性蛋白1，MIP-1和巨噬細(xì)胞炎性蛋白2，MIP-2）的基因表達(dá)水平以及小鼠肝臟成熟巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物（F4/80）的免疫組織化學(xué)染色檢測肝臟巨噬細(xì)胞的浸潤情況和肝內(nèi)炎癥因子水平；Western-blot技術(shù)檢測肝臟

8、胰島素信號通路相關(guān)蛋白（磷脂酰肌醇3激酶,PI3K；AKT和p-AKT）的表達(dá)水平，了解肝臟胰島素信號通路的活化情況。
　　第三部分、選取人類肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，分別予以人白細(xì)胞介素6，（IL-620ng/ml）和人腫瘤壞死因子-α（TNF-α25ng/ml）處理培養(yǎng)，建立體外細(xì)胞炎癥模型。實(shí)驗(yàn)過程中HepG2細(xì)胞加各處理因素后，被分為對照組、TNF-α處理組、IL-6處理組、對照+胰島素組、TNF-α+胰島素處理組和IL-

9、6+胰島素處理組，處理培養(yǎng)24小時后分別進(jìn)行以下試驗(yàn)檢測：HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取和消耗試驗(yàn)，了解HepG2細(xì)胞對葡萄糖的代謝和對胰島素敏感性的變化情況；Western-blot技術(shù)檢測細(xì)胞的胰島素信號通路相關(guān)蛋白（胰島素受體底物1，IRS1；AKT和p-AKT）的表達(dá)水平，了解HepG2細(xì)胞胰島素信號通路的激活情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分、WT小鼠造模喂養(yǎng)12周后各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠的體重和肝臟FA

10、T/CD36蛋白的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；GTT和ITT檢測發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠出現(xiàn)明顯的葡萄糖和胰島素耐量不良；各項(xiàng)血清生化指標(biāo)檢測發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠血清葡萄糖和胰島素的水平明顯升高（P＜0.05）；肝臟組織切片HE和ORO染色以及新鮮肝臟組織TG含量的定量檢測發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大量的空泡樣脂肪變性，肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積和TG的含量明顯增加；肝臟組織蛋白Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，HFD喂養(yǎng)的小鼠肝臟胰

11、島素信號通路（P-AKT/AKT）相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯減少。
　　第二部分、WT和CD36-/-兩組小鼠造模喂養(yǎng)12周期間，對小鼠體重統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，在喂養(yǎng)的第6周后CD36-/-小鼠的體重較WT小鼠明顯減輕，但前者的肝臟體重比卻明顯增加，肝臟飽滿顏色發(fā)白，出現(xiàn)明顯的脂肪肝形態(tài)；血清生化各項(xiàng)檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，CD36-/-小鼠的血清胰島素、TG、FFA、TC和IL-6的水平較WT小鼠明顯增加（P＜0.05）；肝臟組織切片H&E和OR

12、O染色以及新鮮肝組織TG含量的定量檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36基因缺失小鼠的肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯的空泡樣脂肪變性，肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積和TG的含量明顯增加；RT-PCR和F4/80免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36基因缺失小鼠的肝臟巨噬細(xì)胞趨化因子，炎性蛋白和炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），肝臟F4/80黃染程度明顯加重；肝臟蛋白Western Blottting檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36基因缺失小鼠胰島素信號通路（PI3K/

13、AKT）相關(guān)蛋白的表達(dá)水平明顯減少。
　　第三部分、HepG2細(xì)胞葡萄糖攝取和消耗試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥因子（TNF-α、IL-6）處理組的細(xì)胞較對照組對葡萄糖的攝取和消耗明顯減少，同時細(xì)胞加胰島素處理后，炎癥因子處理組的細(xì)胞對胰島素刺激的敏感性明顯降低，葡萄糖的攝取和消耗較對照組細(xì)胞進(jìn)一步減少（P＜0.05）；細(xì)胞蛋白Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，炎癥因子處理組的細(xì)胞較對照組胰島素信號通路（IRS1/PI3K/AKT）相關(guān)蛋白的