CCL21-CCR7軸對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響研究.pdf

1、背景與目的： 近年來，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升的態(tài)勢(shì)。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)占肺癌所有病例的80％以上。由于常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肺癌患者的5年生存率只有15％左右。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是決定肺癌患者預(yù)后的主要因素。隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的靶向分子生物學(xué)研究取得了較大的進(jìn)展，但引導(dǎo)肺癌細(xì)胞定向遷移的確切機(jī)制仍有待研究。CCR7是CC類趨化因子受體的成員之一，其配

2、體CCL21特異的高表達(dá)于淋巴結(jié)的高內(nèi)皮靜脈(high endothelialvenules，HEV)及淋巴管內(nèi)皮中。CCL21/CCR7在免疫和炎癥反應(yīng)的淋巴細(xì)胞定向遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)CCL21/CCR7在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用令人矚目，研究證實(shí)CCL21/CCR7在黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、甲狀腺癌、子宮頸癌和慢性淋巴細(xì)胞白血病的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。已有研究者在NSCLC組織中檢測(cè)到CCR7

3、 mRNA的表達(dá)，但其是否參與了肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的過程還不得而知。為此本研究擬應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肺癌組織中CCR7及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C(Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)蛋白的表達(dá)，并分析其與NSCLC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，然后構(gòu)建表達(dá)CCR7的質(zhì)粒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染．A549細(xì)胞，進(jìn)而檢測(cè)CCL21/CCR7軸對(duì)A549細(xì)胞增殖、鈣內(nèi)流、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)及體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

4、。探討CCL21/CCR-7在肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用與機(jī)制，為探索肺癌新的治療方法提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．收集65例NSCLC患者手術(shù)切除組織存檔蠟塊。免疫組化法分別檢測(cè)肺癌組織中CCR7和VEGF-C蛋白的表達(dá)，分析其與肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并進(jìn)一步探討CCR7聯(lián)合VEGF-C檢測(cè)在診斷NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的價(jià)值。 2．設(shè)計(jì)和構(gòu)建能表達(dá)CCR7 cDNA的質(zhì)粒載體(pEGFP-CCR7)，并以不表

5、達(dá)任何基因的pEGFP-N1質(zhì)粒為陰性對(duì)照，分別通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，經(jīng)G418篩選(800 μg/mL)并穩(wěn)定傳代后，采用WST-1、軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)、激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanningconfocal microscope，LSCM)和Boyden小室模型，檢測(cè)CCL21對(duì)A549-CCR7細(xì)胞和A549-pEGFP細(xì)胞體外增殖、鈣內(nèi)流、遷移和侵襲的影響；然后應(yīng)用Real-Time RT-PCR和Wes

6、tern blot檢測(cè)CCL21對(duì)A549-CCR7細(xì)胞和A549-pEGFP細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達(dá)的影響。 3．將A549-CCR7細(xì)胞和A549-pEGFP細(xì)胞等比例混合，并種植裸鼠爪墊皮下，一周后Real-Time RT-PCR檢測(cè)各級(jí)淋巴結(jié)中CCR7相對(duì)于原位腫瘤組織的表達(dá)量，比較A549-CCR7細(xì)胞和A549-pEGFP細(xì)胞較早淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力。采用裸鼠爪墊皮下種植淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，比較A549-CCR7細(xì)胞和A549-p

7、EGFP細(xì)胞經(jīng)淋巴道晚期發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力，以及對(duì)荷瘤裸鼠生存期的影響。 結(jié)果：1．CCR7和VEGF-C蛋白在NSCLC組織中均有較高表達(dá)，分別達(dá)56.9％和 60％。CCR7和VEGF．C蛋白在NSCLC中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.01)，而且兩者的表達(dá)水平均隨肺癌組織TNM分期升高及伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生而逐漸增強(qiáng)(P<0.01)。聯(lián)合檢測(cè)CCR7和VEGF-C在診斷NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的準(zhǔn)確度是比較高的，ROC曲線下面積

8、達(dá)0.782。 2．培養(yǎng)基中無CCL21存在的情況下A549-CCR7細(xì)胞和A549-pEGFP細(xì)胞體外增殖、鈣內(nèi)流、遷移和侵襲能力均無顯著差異(P>0.05)；在CCL21作用下，與A549-pEGFP細(xì)胞相比A549-CCR7細(xì)胞的體外增殖、鈣內(nèi)流、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。這提示CCL21/CCR7軸能夠增強(qiáng)A549細(xì)胞的體外增殖、鈣內(nèi)流、遷移和侵襲能力。在不表達(dá)CCR7的情況下，有無CCL21對(duì)A549細(xì)

9、胞VEGF-C、MMPs和TIMPs的表達(dá)均無明顯影響(P>0.05)；而在表達(dá)CCR7的情況下，CCL21能夠顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞VEGF-C、MMP-2、9、11的表達(dá)(P<0.01或0.05)，顯著降低TIMP-1，2的表達(dá)(P<0.01或0.05)，但對(duì)MMP-1的表達(dá)無明顯影響(P>0.05)。 3．胭窩、髂動(dòng)脈旁以及腎門淋巴結(jié)中A549-CCR7細(xì)胞的比例均顯著高于原位腫瘤組織(P<0.01)，而且隨著淋巴結(jié)的級(jí)數(shù)增

10、高，A549-CCR7細(xì)胞所占比例有增高的趨勢(shì)。與A549-pEGFP細(xì)胞相比，A549-CCR7細(xì)胞的荷瘤裸鼠生存期顯著縮短(P<0.01)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著提高(P<0.01)。提示CCL21/CCR7軸能夠顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞經(jīng)淋巴道發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力。 結(jié)論： 1．CCR7可作為診斷NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的新型標(biāo)志物，其與VEGF-C聯(lián)合檢測(cè)有助于NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期診斷和確定手術(shù)時(shí)的切除范圍。 2