DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的影響.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種病因未明的累及全身多器官多系統(tǒng)鮑慢性進行性病譜性自身免疫瘋.一般認(rèn)為在遺傳、環(huán)境、內(nèi)分泌及慢病毒等綜合因素作用下,機體正常的免疫耐受機制被破壞,以至CD4+T淋巴細(xì)胞尤其是'l'h2激活,與自身多肽反應(yīng),自身反應(yīng)性B細(xì)胞激活,IgG型自身抗體產(chǎn)生,進而導(dǎo)致SLE發(fā)病.目前關(guān)于SLE遺傳危險因素的研究比較多,但主要集中在HLA及其相關(guān)基因.遺傳免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人類大部分反映其進化過程的基因處于不表達(dá)狀態(tài),如果在

2、某些內(nèi)外因素作用下導(dǎo)致其表達(dá),則可能誘導(dǎo)自身抗原產(chǎn)生,引起自身免疫反應(yīng).表觀遺傳學(xué)觀點較好地解釋了這一現(xiàn)象,認(rèn)為人類遺傳特性的正常表達(dá)不僅取決于基因物質(zhì)的正確性,還受到DNA修飾程度的影響.DNA甲基化是在不改變基因DNA一級結(jié)構(gòu)的情況下,改變其表達(dá)活性的基因外調(diào)節(jié)途徑,是哺乳動物細(xì)胞DNA最普遍的修飾過程,對哺乳動物的進化和發(fā)育有重要的調(diào)控作用.關(guān)于DNA甲基化狀態(tài)在SLE發(fā)病機制中的重要作用已經(jīng)較為明確,然而對于SLE中DNA甲基化

3、異常的形成和調(diào)控機制尚不十分清楚.DNA甲基化狀態(tài)的維持主要受到兩個相反因素的調(diào)控,即甲基轉(zhuǎn)移酶(實現(xiàn)甲基化)和去甲基酶(降低甲基化),本研究旨在探討影響SLE患者DNA甲基化狀態(tài)的調(diào)控因素及其與發(fā)病的相互關(guān)系,將為進一步研究和防治SLE發(fā)病提供新的切入點. 1.通過分析1)SLE患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶:DNMT(DNMTl、DNMT3A、DNMT3B)表達(dá)水平與LFA-1亞基CDlla表達(dá)水平的相互關(guān)

4、系;2)DNMT表達(dá)水平與SLE嚴(yán)重程度的相互關(guān)系,發(fā)現(xiàn)SLE患者PBMC中DNMTl表達(dá)顯著低于對照組,活動期DNMTl表達(dá)水平略低于緩解期.對照組、SLE緩解期與活動期患者PBMC中DNMT3A表達(dá)沒有明顯差異,DNMT3B極少表達(dá).SLE緩解期和活動期PBMC中CDlla表達(dá)明顯高于對照組,活動期CDlla表達(dá)明顯高于緩解期,CDlla表達(dá)的升高與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE-DAI)呈顯著的正相關(guān).CDlla表達(dá)水平與DNMTl表達(dá)水

5、平之間呈負(fù)相關(guān)傾向,但不顯著.DNMTl表達(dá)水平的降低及CDlla表達(dá)的升高在SLE的發(fā)病中可能存在重要價值. 2.通過分析比較中國人SLE患者DNMTl部分外顯子exonl-exon7及相應(yīng)內(nèi)含子(intron)DNA序列與正常人的異同,發(fā)現(xiàn)中國人SLE患者中DNMTl外顯子Exon7與Exon8之間Intron7存在21397位t→c(胸腺嘧啶→胞嘧啶)的轉(zhuǎn)換, 8/11例患者顯示t→c改變,僅3/12例正常人顯示t→c改變

6、,卡方檢驗差異顯著.不同于國外的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白對系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病的影響研究發(fā)現(xiàn),Exon4未發(fā)現(xiàn)g→c的改變.其它外顯子也未見特征性的改變.這種單核苷酸多態(tài)性(SNP)改變可能影響DNMTs活性,進而影響DNA甲基化狀態(tài). 3.通過檢測PBMC中甲基結(jié)合蛋白MeCP2及去甲基化酶MBD2的基因表達(dá)水平,分析1)兩者表達(dá)水平與LFA-1亞基CDlla表達(dá)水平的相互關(guān)系;2)兩者表達(dá)水平與SLE嚴(yán)重程度的相互

7、關(guān)系.發(fā)現(xiàn)MeCP2表達(dá)水平在對照組、SLE緩解期與活動期之間差異并沒有顯著性.SLE緩解期與活動期患者中MBD2轉(zhuǎn)錄水平則非常顯著地高于正常對照,MBD2轉(zhuǎn)錄水平與SLE-DAI呈非常顯著的正相關(guān)關(guān)系和線性回歸關(guān)系,且MBD2轉(zhuǎn)錄水平還與CDlla表達(dá)水平呈非常顯著的正相關(guān)關(guān)系和線性回歸關(guān)系.SLE中的低甲基水平又使得高水平MBD2的結(jié)合量顯著減少,靜默作用減弱甚至消失.MBD2/DNMTl值與SLE-DAl分值的相關(guān)性研究顯示顯著的

8、正相關(guān)和線性回歸關(guān)系,能夠較好地反映SLE發(fā)病中甲基化和去甲基化機制的雙重影響. 4.通過檢測MBD2、Gata3和IL4表達(dá)的量化關(guān)系,探索SLE中MBD2和Gata3表達(dá)水平對SLE中Th2異常分化的影響.發(fā)現(xiàn)SLE中Gata3、MBD2和IL4的表達(dá)水平皆顯著地高于正常對照組.正常人Gata3表達(dá)水平與IL4的表達(dá)水平呈顯著的相關(guān)性和線性回歸關(guān)系,但這種相關(guān)和線性回歸關(guān)系在SLE患者中消失了.SLE患者Gata3表達(dá)水平與

9、刀L4表達(dá)水平雖然相關(guān)性不顯著,仍呈正性傾向.MBD2表達(dá)水平與IL4表達(dá)水平相關(guān)性不顯著,呈負(fù)性傾向.結(jié)果提示: 1.SLE患者PBMC中DNMT1表達(dá)降低可能導(dǎo)致DNA甲基化水平降低,使得包括CDlla在內(nèi)的多種基因過度表達(dá),從而促進SLE發(fā)病;DNMT3A和DNMT3B表達(dá)低下使重頭作用型甲基轉(zhuǎn)移酶不能及時修復(fù),半甲基化的單鏈更少,使以半甲基化單鏈為基礎(chǔ)的DNMT1失去了作用點,低甲基化處于幾乎不可修復(fù)狀態(tài);SLE中CDl

10、la表達(dá)明顯升高并與 SLE-DAI 呈顯著的正相關(guān)提示存在DNMT1降低-甲基化降低-LFA-1合成增加-SLE發(fā)病的機制;DNA低甲基化可能不是由低:DNMT1單一因素決定的,存在多個影響因素共同協(xié)同作用. 2.中國人SLE患者中DNMT1 intron 7存在21397位t→c的轉(zhuǎn)換可能影響編碼子構(gòu)成,導(dǎo)致DNMT1三維構(gòu)型的變化,進而減弱酶的活性. 3. 即使MeCP2的表達(dá)保持在相對穩(wěn)定的水平,SLE患者中DN

11、A甲基化程度的降低也同樣使由MeCP2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制減少;SLE中MBD2轉(zhuǎn)錄水平的顯著升高、與SLE-DAI呈非常顯著的正相關(guān)關(guān)系和線性回歸且與CDlla表達(dá)水平呈非常顯著的正相關(guān)關(guān)系和線性回歸,提示MBD2作為一種去甲基化酶在SLE的低甲基化狀態(tài)形成中至關(guān)重要,加速了基因激活;SLE中的低甲基化水平還使得MBD2結(jié)合量顯著減少,表達(dá)靜默作用減弱甚至消失.這種激活加強和靜默減弱聯(lián)合作用進一步促進了基因的表達(dá),最終導(dǎo)致 LFA-1表達(dá)增

12、加和SLE活動;MBD2/DNMT1值與SLE-DA1分值顯著的正相關(guān)和線性回歸關(guān)系反映了SLE發(fā)病中甲基化和去甲基化機制的雙重影響. 4.正常和穩(wěn)定的基因調(diào)控背景下IL4的表達(dá)直接受到Gata3水平的作用,但這種相關(guān)和線性回歸關(guān)系在SLE患者中消失了,提示可能存在某些中間環(huán)節(jié)的缺損,使SLE中正常的基因調(diào)控背景發(fā)生改變,干擾Gata3-IL4激活機制的實現(xiàn).SLE患者Gata3表達(dá)水平與IL4表達(dá)水平的正性傾向提示患者中IL4

13、表達(dá)可能受到Gata3表達(dá)水平的正性影響;MBD2表達(dá)水平與IL4表達(dá)水平的負(fù)性傾向提示MBD2對IL4表達(dá)可能存在抑制傾向. 總之,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶表達(dá)水平在SLE中啟動子區(qū)CpG基序的甲基化狀態(tài)起到重要作用;SLE中基因緘默的打破不僅依賴于啟動子區(qū)域甲基化程度,而且還依賴于低甲基化造成的MBP結(jié)合降低,MBP的表達(dá)阻遏作用消失;低甲基化不僅使MBP的阻遏作用缺失,可能還影響到MBD2與Gata3的競爭作用,失去對I