基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的槐角多組分分析與藥代動力學研究.pdf

1、槐角為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥成熟果實。冬季采收，除去雜質(zhì)，干燥。中國藥典（2010年版一部）記載其用于清熱瀉火，涼血止血，腸熱便血，痔腫出血，肝熱頭痛，眩暈目赤，為常用中藥?；苯侵泻喾N化學成分，包括黃酮、三萜皂苷、生物堿、磷脂、氨基酸以及多糖等。黃酮是槐角中的一類主要活性成分。迄今為止國內(nèi)外學者對該植物化學成分鑒定與分離研究為較廣泛，而對于其質(zhì)量評價與體內(nèi)藥代動力學研究涉及較少。本研究以槐角為載體，以黃酮類

2、成分為研究對象，以液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)為分析手段，探討復雜體系中中藥成分與其藥代動力學研究。采用HPLC-MS技術(shù)對槐角中的6種黃酮類成分同時進行定量及統(tǒng)計學分析，為槐角的質(zhì)量控制提供新的手段。
　　 藥物代謝動力學是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運用數(shù)學原理和方法闡述血藥濃度隨時間變化規(guī)律的一門學科。隨著藥學相關(guān)學科的不斷發(fā)展及人類健康水平的不斷提高，對藥物的藥代動力學性質(zhì)的要求也越來越嚴格。本

3、研究建立大鼠口服槐角提取物后血漿樣品中包括槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素、山奈酚在內(nèi)的6種黃酮的HPLC-MS定量分析方法，探索其藥代動力學參數(shù);建立灌胃給予大鼠槐角提取物后，大鼠膽汁和尿液中6種黃酮的定量分析方法，研究其體內(nèi)排泄規(guī)律。本文對槐角藥材的多組分分析及藥代動力學研究，將有益于臨床的合理應用。
　　 第一部分液質(zhì)聯(lián)用法同時測定槐角中6種成分的含量及統(tǒng)計學分析
　　 目的:建立同時分離、測定槐角中槐角苷

4、、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素和山奈酚6種黃酮類成分的HPLC-MS定量分析方法，并用于槐角藥材分析。采用主成分分析及聚類分析的統(tǒng)計方法分類和區(qū)分30批不同產(chǎn)地的槐角藥材。
　　 方法:液相色譜柱為DiamonsilC18柱(150×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇∶水（含有0.5‰乙酸），流速為0.8mL/min，分析時間為8min，梯度洗脫。質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI源)，TurboV離子源，采用多反應離子監(jiān)測(MR

5、M)進行負離子檢測。源噴射電壓(IS)為-4500V，霧化溫度為650℃，霧化氣(GS1，N2)為60psi，輔助氣(GS2，N2)為65psi，氣簾氣(N2)為25psi。實驗采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:6種黃酮類化合物的線性關(guān)系良好(r≥0.9904)，檢測限和定量限分別小于3.12ng/mL和12.5ng/mL，日內(nèi)日間精密度分別小于2.07％和2.44％。平均回收率的范圍為96.2％～103.3

6、％，48h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。主成分分析及聚類分析對30批槐角藥材成功分類區(qū)分，證明其道地藥材質(zhì)量最佳。
　　 結(jié)論:該方法簡便快速，靈敏度高，選擇性好，為槐角藥材的質(zhì)量控制提供了新的方法和手段。
　　 第二部分液質(zhì)聯(lián)用法同時測定大鼠血漿中6種黃酮類成分及其藥代動力學研究
　　 目的:建立一種可用于測定大鼠血漿中槐角苷、染料木苷、染料木素、蘆丁、槲皮素和山奈酚含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給予槐角提取物后的

7、藥代動力學研究。
　　 方法:12只大鼠被隨機分為2組。大鼠灌胃給予槐角提取物(2mL/kg)后，分別于給藥后0，10，25，45，60，75，90，120，180，270min（第一組）和0，1.5，3，4.5，6，8，10，12，18，24，30，36，48，72h（第二組）眼內(nèi)眥靜脈叢取血，制備血漿樣品，采用乙酸乙酯液液萃取法進行樣品預處理，磺胺甲噁唑為內(nèi)標。色譜條件:反相DiamonsilC18柱(150×4.6mm，5

8、μm)，流動相為A（甲醇）∶B（0.5‰乙酸水），梯度洗脫:0-1.5min，35％A～75％A;1.5-6.0min,75％A～95％A;6.0-8.0min,95％A;后運行8min，柱溫為25℃，流速為0.8mL/min。質(zhì)譜條件:ESI源，源電壓(IS)-4500V，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(GS1，N2)60psi，輔助氣(GS2，N2)65psi，氣簾氣(N2)25psi，多反應離子監(jiān)測(MRM)模式進行負離子檢測。

9、采用多反應監(jiān)測-信息依賴-增強型子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式對6種化合物結(jié)構(gòu)進行確認。6種被測成分及內(nèi)標的監(jiān)測離子對分別為sophoricoside(431.1/267.9),genistin(431.1/267.9),genistein(269.0/133.0),rutin(609.2/300.0),quercetin(301.0/150.9),kaempferol(284.9/93.0),IS(252.0/155.9)。

10、
　　 結(jié)果:所建立方法的精密度、準確度、檢測限、定量限、穩(wěn)定性、提取回收率和基質(zhì)效應均符合要求，被測6種有效成分在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。藥代動力學試驗數(shù)據(jù)表明，被測成分可分為2類，即黃酮苷（槐角苷、染料木苷、蘆?。┖忘S酮苷元（染料木素、槲皮素、山奈酚）。黃酮苷口服給藥后約1h達到血藥濃度峰值，而黃酮苷元達到血藥濃度峰值約需10～12h。消除速率常數(shù)k變化范圍:黃酮苷0.0117～0.0201，黃酮苷元0.0011～0.001

11、6。說明口服給藥槐角提取物后黃酮苷首先被吸收，然后黃酮苷元再被吸收，且黃酮苷元消除較慢。染料木素出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，推測可能與肝腸循環(huán)及槐角苷和燃料木苷的代謝有關(guān)。
　　 結(jié)論:本研究采用LC-ESI-MS-MS法，建立了同時測定大鼠血漿中槐角6種有效成分含量的方法，可用于槐角中6種有效成分在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究。該方法簡便、快速、靈敏度高、專屬性好，可用于槐角6種有效成分在大鼠血漿中的定量分析，該法對槐角藥材的體內(nèi)定量分析具有重

12、要意義，有助于傳統(tǒng)中藥槐角的臨床應用。
　　 第三部分液質(zhì)聯(lián)用法同時測定大鼠膽汁和尿液中6種黃酮類成分及排泄動力學研究
　　 目的:建立HPLC-MS法同時測定大鼠口服槐角提取物后膽汁和尿液中6種黃酮類化合物含量的方法，進行排泄動力學研究。
　　 方法:色譜柱為DiamonsilC18柱(150×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇:水（含有0.5‰乙酸），梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI源)，負離子監(jiān)測，采

13、用多反應監(jiān)測模式(MRM)。內(nèi)標為磺胺甲噁唑(SMZ)。大鼠灌胃給予槐角提取物2.5mL/kg，膽汁按照0-2，2-4，4-6，6-8，8-12，12-24，24-30，30-36h收集，尿液按照0-4，4-8，8-12，12-24，24-36,36-48，48-60，60-72，72-96h時間段收集。樣品經(jīng)乙酸乙酯液液萃取。
　　 結(jié)果:膽汁和尿液中6種化學成分在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系(r≥0.9952)，日內(nèi)日

14、間精密度均小于15％，相對誤差RE均在±15％內(nèi)。在膽汁樣品中提取回收率范圍是64.9％～81.5％，基質(zhì)效應范圍是85.7％～105.5％。尿液樣品中提取回收率范圍為66.7％～83.2％，基質(zhì)效應范圍為87.4％～103.0％。膽汁及尿液樣品穩(wěn)定性良好。膽汁排泄藥動學試驗表明，6種黃酮類化合物在36h之內(nèi)基本排泄完全，累積排泄百分數(shù)分別為0.058％，0.712％，0.966％，0.026％，0.261％，0.680％。尿液排泄藥動