基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的當(dāng)藥多組分分析與藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)（中醫(yī)）已用于臨床實(shí)踐了幾千年。在中醫(yī)治療體系中，中藥對(duì)疾病的預(yù)防和治療起著不可或缺的作用，尤其是復(fù)雜和慢性病的治療。Swertia pseudochinensis（在中國(guó)稱為當(dāng)藥），中藥的重要成員，是獐牙菜Swertia pseudochinensis Hara的干燥全草，并已被列入中國(guó)人民共和國(guó)2010年的藥典。當(dāng)藥屬龍膽科獐牙菜屬藥材，在中國(guó)現(xiàn)已被用于治療消化功能減退，急性和慢性痢疾，肝炎。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的當(dāng)藥具有眾多的藥理

2、作用，已被發(fā)現(xiàn)的有健胃，利膽，保肝，解熱作用。在國(guó)內(nèi)當(dāng)藥主要用于當(dāng)飛利肝寧膠囊的生產(chǎn)制備。當(dāng)藥中的主要活性成分包含的裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類，黃酮類和氧雜蒽酮類等。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷、龍膽苦苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷同時(shí)測(cè)定。建立并驗(yàn)證了一種快速準(zhǔn)確的LC-MS/MS方法同時(shí)測(cè)定該6種分析物。對(duì)中藥采用HPLC-MS-MS并結(jié)合化學(xué)計(jì)量技術(shù)對(duì)生物活性成分同時(shí)定量是一種可靠的方法，對(duì)當(dāng)藥的全面控制質(zhì)量具有重要作用。
　　為闡明

3、天然產(chǎn)物和中藥(TCM)的活性成分的體內(nèi)作用機(jī)制，藥代動(dòng)力學(xué)研究是必不可少的。由于中藥的療效是基于多種成分間復(fù)雜的相互作用，當(dāng)藥提取物給藥后多組分的藥代動(dòng)力學(xué)研究的研究是必不可少的。本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證了一種新的大鼠血漿中同時(shí)分析獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的LC-MS/MS方法。該分析方法已成功應(yīng)用于口服當(dāng)藥提取物后多個(gè)活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　當(dāng)藥苷（C16H22O9，分子量358.344），環(huán)烯

4、醚萜苷，廣泛存在于獐牙菜屬植物中并表現(xiàn)出多種的藥理學(xué)和生物學(xué)活性。現(xiàn)代藥理表明當(dāng)藥苷具有許多的藥理學(xué)和生物活性，其中包括保肝作用，抗增殖，血管舒張，抗肝損傷，抗炎和抗過(guò)敏等作用。在本項(xiàng)研究中，開(kāi)發(fā)了一種高性能的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法與電噴霧電離（HPLC-ESI-MS/MS）方法并成功地應(yīng)用于當(dāng)藥苷的大鼠生物樣品如血漿，組織，膽汁，尿液和糞便中的定量。本實(shí)驗(yàn)研究了在健康SD大鼠中當(dāng)藥昔的藥代動(dòng)力學(xué)，組織分布和排泄研究，并進(jìn)行了單次口服（三

5、個(gè)劑量）給藥和靜脈給藥當(dāng)藥苷后的藥動(dòng)學(xué)研究。當(dāng)藥苷的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、分布和排泄方面的研究將為合適的劑型設(shè)計(jì)和臨床的合理用藥提供有用的信息。
　　第一部分、液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定當(dāng)藥中6種成分的含量
　　目的:建立一種高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)，對(duì)當(dāng)藥中的環(huán)烯醚萜類和黃酮苷進(jìn)行體外定量，被測(cè)成分為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷。
　　方法:色譜柱:Diamonsi

6、l C18（迪馬公司，150mm×4.6mm，5μm），柱溫度保持在30℃，進(jìn)樣量為20μL。流動(dòng)相:A（甲醇）和B（0.1％甲酸，V/V），使用梯度洗脫如下:0-4.5 min，45％A～70％A;4.5-4.6 min，70％A～95％A;4.6-10.0 min，95％A;再快速返回初始比例A-B(45∶55，V/V)。后運(yùn)行時(shí)間6min。液相流量設(shè)定為0.8mL/min?？傔\(yùn)行時(shí)間為10.0min。采用正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)的多反應(yīng)監(jiān)

7、測(cè)(MRM)模式對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。離子噴霧電壓為5500和-4500V，源溫度(TEM)650℃;霧化氣(GS1，N2)60 psi，輔助氣(GS2，N2)65 psi，氣簾氣(N2)25 psi。
　　結(jié)果:該方法具有較高的敏感度和特異性，成功應(yīng)用于同時(shí)測(cè)定當(dāng)藥中的活性成分。6種被測(cè)成分的峰面積和濃度在測(cè)定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限、定量限、精密度和穩(wěn)定性均符合要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均高于0.995。日內(nèi)和日間的

8、精密度(RSD)分別小于2.39％和3.47％。平均回收率在96.5％-105.1％之間。被分析成分48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。該方法已成功地應(yīng)用于不同產(chǎn)地來(lái)源的30批次的當(dāng)藥樣品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的定性和定量分析。該結(jié)果表明，環(huán)烯醚萜類成分是當(dāng)藥中的主要活性成分（尤其是獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷）
　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LC-ESI-MS/MS方法適用于當(dāng)藥體外定量的常規(guī)分析，對(duì)當(dāng)藥的質(zhì)量控制提供了全面

9、可靠的方法。
　　第二部分、液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中3種環(huán)烯醚萜類及3種黃酮類成分及其藥代動(dòng)力學(xué)研究
　　目的:建立和驗(yàn)證一種LC-MS/MS方法在大鼠體內(nèi)同時(shí)測(cè)定獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷，并成功應(yīng)用于口服給藥當(dāng)藥提取物后大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究。
　　方法:采用反相Diamonsil C18柱(150×4.6mm，5μm)，柱溫為30℃。洗脫劑A（甲醇）和B（0.1％甲酸水;V/V）的線

10、性梯度洗脫。使用以下梯度條件:初始0-4.5min，45％A～70％A;4.5-4.6 min，70％A～95％A;4.6-10min，等度洗脫95％A。ESI源操作條件如下:離子噴霧電壓為5500和-4500伏，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(GAS1)和加熱氣(GAS2)分別設(shè)定為60和65 psi。簾氣保持在25 psi，接口加熱。全程通入氮?dú)?。?dāng)藥（100克）的干燥粉末70％乙醇回流提取三次(1∶20，1∶20，1∶10 w/

11、v)，每次60min?？诜o藥當(dāng)藥提取物（4mL/kg）后大鼠眼內(nèi)眥取血約0.3 mL，血液樣品被收集在含有肝素的離心管中。血樣采集時(shí)間為0（給藥前），5，10，25，40，60，75，105，150，240和360 min。將血液樣品以4000rpm離心10分鐘，取上清50μL轉(zhuǎn)移到清潔的離心管中，于-20℃保存。血漿樣品處理采用液液萃取方法(LLE)，樣品處理后通過(guò)HPLC/MS方法對(duì)環(huán)烯醚萜類成分、黃酮類成分及IS進(jìn)行分析。

12、>　　結(jié)果:線性參數(shù)和6種的被分析物的LLOQ表明，各化合物在試驗(yàn)范圍濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均高于0.99。對(duì)QC樣品在三個(gè)濃度下進(jìn)行測(cè)定，日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度良好。各成分提取回收率介于76.2％和102.5％之間，基質(zhì)效應(yīng)介于86.2％和102.6％之間。被分析物穩(wěn)定性良好。在大鼠血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究中，被測(cè)組分被分成兩組:環(huán)烯醚萜苷和黃酮苷類。應(yīng)用非房室模型來(lái)計(jì)算的該實(shí)驗(yàn)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在環(huán)烯醚萜類物質(zhì)中，當(dāng)

13、藥苷在10min即達(dá)到最高血藥濃度，而獐牙菜苦苷和龍膽苦苷則在40min。在黃酮類物質(zhì)中，芒果苷、異葒草苷和異牡荊苷的達(dá)峰時(shí)間均為25min。獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷、龍膽苦苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷的AUC0→t分別為94640.7、38828.4、82181.3、13425.6、3296.31和811.318 ng min/mL。無(wú)論是當(dāng)藥藥材中的含量或大鼠血漿中的AUC的對(duì)比均發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類成分遠(yuǎn)高于黃酮苷類成分。這表明，當(dāng)藥中黃酮

14、苷類的生物利用度明顯低于環(huán)烯醚萜類成分?？偟膩?lái)看，當(dāng)藥中6中被測(cè)活性成分在大鼠體內(nèi)迅速吸收，在5 min處均可檢測(cè)到，隨后快速吸收達(dá)到最大濃度，最終在口服給藥360 min后血藥濃度降低至定量限附近。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次建立了一種新型LC-MS/MS方法對(duì)大鼠血漿中的獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素和異牡荊苷同時(shí)定量研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)簡(jiǎn)潔的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理并在較短時(shí)間內(nèi)完成分析。該分析方法已成功應(yīng)用于口服給藥當(dāng)藥苷

15、提取物后被分析物的藥代動(dòng)力學(xué)研究。其結(jié)果對(duì)當(dāng)藥作用機(jī)理的進(jìn)一步研究有所幫助，并可為該中藥的臨床應(yīng)用提供有效參考。
　　第三部分、液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定大鼠血漿中當(dāng)藥苷單體的含量及藥代動(dòng)力學(xué)特征、組織分布和排泄研究
　　目的:開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證一種HPLC-MS方法分析大鼠血漿、組織、膽汁、尿液和糞便中的當(dāng)藥苷。
　　方法:色譜分離采用Diamonsil C18柱（迪馬公司，150mm×4.6mm，5μm）進(jìn)行。該柱溫度保持在30℃，進(jìn)

16、樣量為20μL。流速設(shè)定為0.8mL/min。為了減少污染流入離子源，排出前2 min的洗脫液。使用ESI源，使用以下條件在正離子模式下運(yùn)行:電壓為5500V，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(GAS1)和加熱氣(GAS2)分別設(shè)定為60和65 psi。簾氣為25 psi，接口加熱。CXP和EP被設(shè)定為5.0 V和10.0 V。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)藥苷和獐牙菜苦苷(IS)使用的離子對(duì)分別為m/z359.1-m/z197

17、.2和m/z397.4-m/z165.3。離子對(duì)的滯留時(shí)間(dwell time)設(shè)定為200ms。在當(dāng)藥苷的藥動(dòng)學(xué)研究中，大鼠在三種劑量（5，10，15 mg/kg）下進(jìn)行口服給藥以及1 mg/kg單一劑量下進(jìn)行靜脈注射給藥，將SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組6只）用于口服及靜脈注射給藥?？诜o藥后分別在5，15，30，45，60，90，120，180，270，360，540，720min時(shí)間點(diǎn)處眼內(nèi)眥取血，靜脈注射給藥后則在5，10，20

18、，30，45，60，75，90，120，150min時(shí)間點(diǎn)處取血。將血液樣品立即轉(zhuǎn)移到肝素化管中，并以4000rpm離心5分鐘。將上層血漿轉(zhuǎn)移到清潔的離心管中，于-20℃保存。在當(dāng)藥苷組織分布的研究中，大鼠隨機(jī)分為4組(n=5)?？诜o藥當(dāng)藥苷單體10 mg/kg后，分別在30，60，120min和6h時(shí)間點(diǎn)處收集心臟，肝，肺，脾，腎和腦樣品。在膽汁排泄研究中，口服給藥當(dāng)藥苷單體10 mg/kg后，分別在0-0.5，0.5-1，1-2，

19、2-3，3-4，4-5，5-6，6-8，8-12和12-24h時(shí)間段收集膽汁，量取膽汁體積，并保存于-20℃。在尿液和糞便排泄研究中，尿液和糞便分別在0-2，2-6，6-12，12-24，24-36和36-48 h時(shí)間段收集。在本研究中，采用常規(guī)蛋白沉淀法用于各生物樣品（血漿、組織勻漿、尿液、糞便和膽汁）中當(dāng)藥苷和IS的提取。
　　結(jié)果:各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.992。日內(nèi)和日間精密度值(RSD，％)均小于11.2％，準(zhǔn)確度

20、(RE，％)介于-10.56和13.47％之間。當(dāng)藥苷在各基質(zhì)中的提取回收率在76.12-89.21％之間。不同基質(zhì)中當(dāng)藥苷的基質(zhì)效應(yīng)均在80％-120％之間。穩(wěn)定性結(jié)果表明，該當(dāng)藥苷定量方法在大鼠各基質(zhì)中穩(wěn)定性良好。本實(shí)驗(yàn)中HPLC-MS方法已成功應(yīng)用于當(dāng)藥苷單劑量口服給藥（5，10，15 mg/kg）和靜脈注射給藥（1 mg/kg）的藥代動(dòng)力學(xué)研究中。應(yīng)用非房室模型進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算。由口服給藥和靜脈注射給藥AUC對(duì)比得出當(dāng)藥昔的絕

21、對(duì)生物利用度（F％）為11.9±1.33％。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，當(dāng)藥苷能在大鼠體內(nèi)快速達(dá)到Cmax，隨后快速消除，這暗示當(dāng)藥苷在體內(nèi)的藥理作用起效較快，作用時(shí)間較短。當(dāng)藥苷三種口服劑量（5，10，15 mg/kg）下的AUC0-。。分別為39673.2 ngmin/mL，71983.6 ng min/mL和113578 ng min/mL。說(shuō)明當(dāng)藥苷口服劑量和大鼠體內(nèi)吸收成線性關(guān)系。因此，本研究結(jié)果表明，當(dāng)藥苷在所研究劑量范圍內(nèi)呈線性的

22、藥代動(dòng)力學(xué)特征。在組織分布研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥苷可快速?gòu)V泛的分布至各個(gè)組織。結(jié)果表明，當(dāng)藥苷主要分布器官為腎，肝，脾，肺，此外還有少量的藥物可以滲透到心臟和腦組織。由此看出當(dāng)藥苷主要分布于供血豐富組織，這意味著器官的血流量或灌注率是影響當(dāng)藥苷分布的關(guān)鍵因素。而在大腦中的可檢測(cè)的少量的當(dāng)藥苷表明其能穿越血-腦屏障(BBB)。當(dāng)藥苷在膽汁、尿液和糞便中的排泄數(shù)據(jù)顯示僅有2.678％（膽汁0.674％，尿液1.546％，糞便0.458％）的當(dāng)藥苷

23、以原型排出。由于具有良好的水溶性，當(dāng)藥苷可以快速通過(guò)腎小管排泄，因此主要的排泄途徑為尿液。當(dāng)藥苷在膽汁中的低排泄率說(shuō)明只有少量當(dāng)藥苷原型藥物由膽汁排泄，這可能是由于肝臟首過(guò)效應(yīng)或其他代謝過(guò)程所導(dǎo)致的。以上結(jié)果表明，當(dāng)藥苷主要通過(guò)轉(zhuǎn)化成其他代謝產(chǎn)物進(jìn)行排泄。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)大鼠口服及靜脈給藥當(dāng)藥苷后的藥代動(dòng)力學(xué)，組織分布和排泄進(jìn)行研究。建立了一種快速、可靠、靈敏的HPLC-MS方法對(duì)大鼠生物樣品如血漿、尿液、膽汁、糞便和組織