基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的溪黃草多組分分析與藥動學(xué)特征及冬凌草指紋圖譜研究.pdf

1、溪黃草和冬凌草為唇形科香茶菜屬植物溪黃草與冬凌草的干燥地上部分。該屬植物在亞洲東部和非洲西部廣為分布，全世界約有150種。我國約有90種25個變種。其中約有30種民間作為藥用，作為清熱解毒、抗癌消炎、健脾、活血、抗菌藥來使用。人們對該屬埴物的二萜類成分作了大量研究，已從中提取了百余種二萜類成分。經(jīng)藥理篩選發(fā)現(xiàn)許多二萜化合物具有細(xì)胞毒、抗腫瘤、抗炎活性作用。迄今，國內(nèi)外學(xué)者對該屬植物化學(xué)成分鑒定與分離研究為較廣泛，而對于其質(zhì)量評價(jià)與體內(nèi)外

2、代謝研究較少涉及。然而由于香茶菜屬植物基源相近，所含化學(xué)成分十分類似，對其質(zhì)量控制及評價(jià)十分重要。二萜類是香茶菜屬植物中的一類主要活性成分，但由于種類多樣且含量較低，使其深入研究受到限制。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)具有專屬、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，是混合物中化學(xué)成分定性和定量分析的有力工具。本研究采用HPLC-MS技術(shù)建立溪黃草中27種成分同時(shí)定量的分析方法，并用于不同產(chǎn)地的溪黃草藥材的比較；建立大鼠血漿樣品中7種藥理作用明確的

3、二萜類成分的HPLC-MS定量分析方法，并用于大鼠灌胃給予北溪黃草提取物后7種成分的藥代動力學(xué)研究，闡明其藥代動力學(xué)參數(shù)；建立大鼠膽汁樣品中12種二萜類成分的HPLC-MS定量分析方法，并用于大鼠灌胃給予溪黃草提取物后12種二萜在膽汁中的排泄研究；采用HPLC-UV法對18批冬凌草藥材的指紋圖譜進(jìn)行比較研究，為科學(xué)評價(jià)與有效控制冬凌草藥材質(zhì)量提供簡便、可靠的分析方法。
　　 第一部分、液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定溪黃草中27種成分的含量<

4、br>　　 目的：建立一種快速、準(zhǔn)確、可同時(shí)測定溪黃草中27種化學(xué)成分(18種二萜類成分、6種酚酸和2種黃酮)的HPLC-ESI-MS分析方法，并用于溪黃草藥材的分析。
　　 方法：由MRM-IDA-EPI模式對27種化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，采用MRM正負(fù)離子掃描模式建立其含量測定方法，并采用所建立的方法對45批不同產(chǎn)地的溪黃草藥材進(jìn)行分析。質(zhì)譜條件：ESI源；正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測；源噴射電壓(IS):5500V（正離子監(jiān)測模式），-

5、4500V（負(fù)離子監(jiān)測模式）；離子源溫度：500℃。霧化氣(Gasl):40psi，加熱氣(Gas2):50psi，簾氣：25psi。27種被測成分的監(jiān)測離子對分別為sodoponin(426.4/331.3)，effusanin A(349.3/331.3),enmein(363.3/281.3),lasiodonin(365.3/347.3),epinodosinol(382.3/347.3),oridonin(365.3/347.

6、3),nervosaninB(384.4/349.3),serrinB(377.4/359.3),isodonoiol(407.4/329.2),shikokianidin(491.4/329.2),rabdosinate(535.4/295.3)，epinodosin(361.2/287.1),nodosin(361.1/257.1),ponicidin(361.2/299.1),enmenol(365.2/347.2),lasiok

7、aurin(405.2/58.9)，lasiokaurinol(407.3/58.9)，原兒茶醛(136.9/107.9)，水楊酸(136.9/92.9)，阿魏酸(193.0/133.9)，咖啡酸(179.3/135.3)，綠原酸(353.1/191.0)，迷迭香酸(359.0/160.9)，槲皮素(301.1/151.0)，異鼠李素(315.1/300.3)，蘆丁(609.5/300.1)。色譜條件：色譜柱：Diamonsil-C18

8、(250mm×4.6mm，5μm，Dikma，美國)；柱溫：25℃；流動相：0.1％甲酸-甲醇（含0.1％甲酸）梯度洗脫；分析時(shí)間：15min;流速：0.7mL/min。
　　 結(jié)果：在測定的濃度范圍內(nèi)27種化學(xué)成分均具有良好的線性關(guān)系，精密度、準(zhǔn)確度、檢測限和定量限均符合要求。樣品測定結(jié)果表明，溪黃草產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時(shí)間和用藥部位均對27種活性成分的含量有影響，對其進(jìn)行規(guī)范化種植是保證其質(zhì)量的最有效手段。
　　 結(jié)

9、論：本法簡便、快速、專屬性好，可用于溪黃草中27種化學(xué)成分的含量測定，該法對于溪黃草藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。
　　 第二部分、液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定大鼠血漿中7種二萜類成分及其藥代動力學(xué)研究
　　 目的：建立一種可同時(shí)測定大鼠血漿中epinodosin，epinodosinol，nodosin，oridonin，lasiokariurinol，lasiokaurin和rabdoterninA含量的HPLC-MS方法，并用

10、于大鼠灌胃給予溪黃草提取物后7種成分的藥代動力學(xué)研究。
　　 方法：大鼠灌胃給予溪黃草提取物(10mL/kg)后，分別于給藥后10，30，60，90，105，120，150，180，240，300，480，600，720min眼內(nèi)眥靜脈叢取血，制備血漿樣品，采用乙酸乙酯液液萃取法進(jìn)行樣品預(yù)處理，磺胺甲惡唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱，流動相為0.1％甲酸-甲醇（含0.1％甲酸）梯度洗脫，流速0.7mL/min，運(yùn)行時(shí)間為15.05m

11、in。采用電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測，同時(shí)為了獲得較高的靈敏度我們將檢測過程分割成5個不同的檢測時(shí)間段，即多時(shí)間段檢測模式。這種方法可以實(shí)現(xiàn)在一針樣品運(yùn)行中對正負(fù)離子同時(shí)進(jìn)行監(jiān)測。7種被測成分的監(jiān)測離子對分別為epinodosin(361.2/287.1)，epinodosinol(382.3/347.3),nodosin(361.2/257.1),oridonin(365.3/347.3),l

12、asiokaurinol(407.3/329.1)，lasiokaurin(405.2/59.0)，rabdoterninA(363.2/283.1)和磺胺甲惡唑(254.1/156.0)。
　　 結(jié)果：血漿中epinodosin，epinodosinol，nodosin，oridonin，lasiokaurinol，lasiokaurin和rabdoterninA在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，精密度、準(zhǔn)確度、檢測限和定

13、量限均符合要求。大鼠單次灌胃給予溪黃草提取物后，血漿中該7種成分的藥代動力學(xué)參數(shù)具有一致性，且7種成分的吸收和消除均較快，但epinodosinol，nodosin，oridonin，lasiokaurinol，lasiokaurin和rabdoterninA的達(dá)峰時(shí)間較epinodosin晚。
　　 結(jié)論：該法靈敏度高、選擇性好、精密度好，可用于大鼠灌胃給予溪黃草提取物后，血漿中epinodosin，epinodosinol，

14、nodosin，oridonin，lasiokaurinol，lasiokaurin和rabdoterninA的藥代動力學(xué)研究，該結(jié)果可為溪黃草臨床用藥提供參考依據(jù)。
　　 第三部分、液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定大鼠膽汁中12種二萜成分
　　 目的：建立一種LC-ESI-MS法同時(shí)測定口服溪黃草提取物后大鼠膽汁中12種二萜成分含量的方法，探討該藥在大鼠膽汁中的排泄規(guī)律，為二萜類成分自大鼠膽汁中的排泄研究提供測定方法。
　　

15、 方法：大鼠灌胃給予溪黃草提取物(10mL/kg)后，麻醉進(jìn)行膽管插管手術(shù)，收集0～1h，1～2h，2～3h，3～4h，4～6h，6～8h，8～10h，10～12h，12～20h，20～28h，28～36h膽汁，采用液液萃取法進(jìn)行樣品預(yù)處理，SMZ為內(nèi)標(biāo)。色譜柱為C18柱，流動相為0.01％甲酸水-甲醇（含0.01％甲酸）梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間為15min。采用電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測；源噴射電壓(IS):5500V（正離子

16、監(jiān)測模式），-4500V（負(fù)離子監(jiān)測模式）；離子源溫度：500℃。霧化氣(Gasl):40psi，加熱氣(Gas2):50psi，簾氣：25psi。15種被測成分的監(jiān)測離子對分別為effusaninA349.3/331.3,nodosin363.3/253.1,enmein363.3/281.3,lasiodonin365.3/347.3,epinodosinol382.3/347.3,oridonin365.3/347.3,rabdo

17、sinate535.4/295.3,epinodosin361.2/287.1,pinodosin361.2/363.2,lasiokaurin405.2/59.0，lasiokaurinol407.3/329.1，Hebeirubesensin K365.2/299.2和磺胺甲惡唑254.1/156.0。
　　 結(jié)果：膽汁中12種化學(xué)成分在測定濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，精密度、準(zhǔn)確度、檢測限和定量限均符合要求。12種分析

18、物的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別小于7.9％和9.5％，準(zhǔn)確度相對誤差(RE)為-9.6％～8.9％。提取回收率均均處于88.9％～108.7％范圍內(nèi)。大鼠灌胃給予溪黃草提取物10mL/kg后在0～36h內(nèi)，10種二萜(1-4、6-10、12)由膽汁排泄的累積排泄率大于0.0001％，分別為：0.0302％、0.6361％、2.6722％、0.0165％、0.0371％、0.0126％、0.0032％、0.0445％、0.047

19、27％、0.000332％、0.0565％;其余2種二萜(5、11)累積排泄率小于0.0001％。
　　 結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可滿足大鼠口服給予溪黃草提取物后膽汁排泄研究中藥物濃度測定的要求，該結(jié)果可為溪黃草臨床用藥提供參考。
　　 第四部分、不同產(chǎn)地冬凌草藥材的指紋圖譜研究與PCA分析
　　 目的：研究并建立不同產(chǎn)地冬凌草藥材的指紋圖譜，為科學(xué)評價(jià)與有效控制冬凌草藥材質(zhì)量提供可靠的方法。<

20、br>　　 方法：采用HPLC-UV對18批冬凌草藥材的指紋圖譜進(jìn)行比較研究，同時(shí)應(yīng)用2種不同的分析方法（主成分分析法和相似度分析法）對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以找出來自4個不同產(chǎn)地18批中藥冬凌草樣品間的相似性及差異性。色譜柱為DiamonsilTMC18柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫為30℃；檢測波長為238nm，流動相為甲醇-乙腈-0.05％磷酸水進(jìn)行梯度洗脫，流檢測波長為238nm，流動相為甲醇-乙腈-0.05％磷酸水進(jìn)