基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的馬糞海膽、柄海鞘指紋圖譜及活性成分篩選方法研究.pdf

1、近年來,現(xiàn)代分析技術(shù)尤其是液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)得到了迅速發(fā)展。其在天然藥物化學(xué)、藥物分析、藥物篩選、中藥現(xiàn)代化等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用均極大地促進了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。本文采用LC-MS聯(lián)用技術(shù),以馬糞海膽、柄海鞘等海洋藥用生物為研究對象,發(fā)展了基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的海洋藥用生物指紋圖譜、核苷類化合物測定、抗氧化活性成分和乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選新方法,為我國海洋藥用生物的真?zhèn)舞b別和活性成分快速發(fā)現(xiàn)研究提供了方法學(xué)參考。主要研究內(nèi)容及結(jié)果

2、簡述如下:
　　 1.將高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜技術(shù)用于兩種海洋藥用生物馬糞海膽和柄海鞘的真?zhèn)舞b別。首先,發(fā)展了馬糞海膽和柄海鞘HPLC指紋圖譜分析方法,在本文優(yōu)化的色譜條件下,兩種海洋藥用生物提取物中各化合物分離良好。方法學(xué)考查結(jié)果表明,兩種方法均具有較好的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,可以滿足指紋圖譜的要求。通過對多批次馬糞海膽和柄海鞘樣品進行分析,分別構(gòu)建了馬糞海膽和柄海鞘的HPLC特征指紋圖譜,結(jié)合相似度分析成功實現(xiàn)了

3、對兩種海洋藥用生物的真?zhèn)舞b別。說明HPLC指紋圖譜法是馬糞海膽和柄海鞘真?zhèn)舞b別的有效方法。
　　 2.首次建立了親水色譜-電噴霧飛行時間質(zhì)譜法(HILIC-ESI-TOF/MS)測定柄海鞘、馬糞海膽等海洋藥用生物中16種核苷類化合物(包括:腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苷、腺苷、鳥苷、胞苷、胸苷、尿苷、2'-脫氧鳥苷、2'-脫氧胞苷、2'-脫氧腺苷)的方法,并在此基礎(chǔ)上探索性的發(fā)展了基于16種核苷

4、類化合物分布特征的海洋藥用生物指紋圖譜新方法。采用HILIC-ESI-TOF/MS測定海洋藥用生物中核苷類化合物,在本文優(yōu)化的儀器條件下,各核苷類化合物分離良好,采用ESI-TOF/MS為檢測器相對于紫外檢測器具有更高的靈敏度和選擇性,可以實現(xiàn)對海洋藥用生物復(fù)雜基質(zhì)中微量核苷類化合物的準確定性、定量。柄海鞘、馬糞海膽等海洋藥用生物中核苷類化合物的測定結(jié)果表明,同一種海洋藥用生物中各核苷類化合物含量相似,不同海洋藥用生物中各核苷類化合物含

5、量存在顯著不同。另外,采用基于16種核苷類化合物的指紋圖譜,結(jié)合相似度分析和聚類分析,用于不同海洋動物藥的鑒別。結(jié)果表明,基于核苷類化合物的指紋圖譜能反映不同海洋動物藥各自的固有特征,結(jié)合相似度分析和聚類分析,可實現(xiàn)對不同海洋動物藥的正確區(qū)分。說明核苷類化合物指紋圖譜有望成為海洋藥用動物鑒別的新方法。
　　 3.發(fā)展了1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除活性評價結(jié)合LC-MS篩選、鑒別海洋藥用生物中抗氧化成分的方法,并應(yīng)

6、用于馬糞海膽中抗氧化成分的篩選和鑒別。首先,利用DPPH自由基清除活性評價實驗,對馬糞海膽不同溶劑提取物的自由基清除活性進行比較,結(jié)果表明,馬糞海膽水提物的自由基清除活性最好,潛在抗氧化能力最強。其次,建立了基于自由基清除劑色譜峰變化的DPPH-HPLC抗氧化成分篩選方法,結(jié)合ESI-TOF-MS分析,可實現(xiàn)對海洋藥用生物粗提物中抗氧化成分的快速篩選和鑒別。結(jié)果在馬糞海膽水提物中篩選到9種抗氧化成分,根據(jù)測得各化合物的質(zhì)譜信息、UV圖,

7、結(jié)合數(shù)據(jù)庫對其進行了初步鑒定。另外,對馬糞海膽殼的乙醚提取物中的抗氧化成分也進行了篩選,發(fā)現(xiàn)了4種弱極性抗氧化成分,采用大氣壓化學(xué)電離飛行時間質(zhì)譜(APCI-TOF/MS)分析,獲得了各化合物的精確分子量信息,結(jié)合文獻和數(shù)據(jù)庫鑒定為4種萘醌類色素。綜上可以看出,本文發(fā)展的DPPH自由基清除活性評價結(jié)合LC-MS分析篩選、鑒別海洋藥用生物中抗氧化成分的方法,集活性篩選、質(zhì)譜鑒別于一體,相比于傳統(tǒng)方法效率高、速度快,為海洋藥用生物中抗氧化活

8、性成分的快速篩選、鑒別提供了方法支持。
　　 4.建立了親和超濾.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(AS/UF-LC-MS)快速篩選、鑒別海洋藥用生物中乙酰膽堿酯酶抑制劑的新方法。首先,采用酶抑制活性評價實驗對馬糞海膽、柄海鞘不同溶劑提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性進行了比較,結(jié)果表明,柄海鞘乙酸乙酯提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性最強。其次,對孵化條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化,在此基礎(chǔ)上建立了AS/UF-HPLC-ESI-TOF/MS篩選、鑒別乙酰膽堿酯酶