中藥川芎揮發(fā)性成分分析及藥代動力學(xué)研究.pdf

1、藥物代謝研究在藥物研究與開發(fā)中占有舉足輕重的地位,中藥活性成分代謝的研究近年來越來越多地引起人們的關(guān)注。本論文以傳統(tǒng)中藥川芎為對象,提取其中的揮發(fā)油,并分析其化學(xué)成分,比較幾種提取方法所得揮發(fā)油化學(xué)組成成分上的差異；從揮發(fā)油中分離純化制備得到主要有效成分藁本內(nèi)酯單體的對照品；建立了HPLC法測定揮發(fā)油以及生物樣品中藁本內(nèi)酯的含量；并應(yīng)用此方法研究了口服給以川芎揮發(fā)油后,藁本內(nèi)酯在小鼠和大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)動態(tài)變化過程以及生物轉(zhuǎn)化情況；研究了

2、藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各組織間的分布特性；同時還建立了LC-ESI-MS法測定肝微粒體孵育液中的藁本內(nèi)酯,并應(yīng)用該方法開展了藁本內(nèi)酯在肝微粒體中的體外代謝研究；研究結(jié)果顯示藁本內(nèi)酯在體內(nèi)和體外存在生物轉(zhuǎn)化,且有一定的差異。 本論文通過上述研究,豐富了中藥藥物代謝和藥動學(xué)的研究內(nèi)容,為臨床合理用藥提供了理論的參考,為中藥現(xiàn)代化研究進行了有利的探索。 藥物代謝動力學(xué)研究在藥物的研究開發(fā)和合理應(yīng)用中具有極其重要的意義,對中藥活性成

3、分的代謝動力學(xué)研究,近幾年來也引起了人們的廣泛重視。中藥代謝動力學(xué)研究的內(nèi)容非常豐富,生物樣本成分復(fù)雜,測定的目標(biāo)有效成分濃度非常低,干擾物質(zhì)多,既存在內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,又有主要代謝產(chǎn)物的干擾,還有中藥中其他成分的干擾。然而,隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的迅速發(fā)展,新的檢測技術(shù)不斷的出現(xiàn),給中藥藥代動力學(xué)研究提供了高靈敏度、高精密的、高準(zhǔn)確度的分析檢測手段,推動了中藥藥代動力學(xué)的發(fā)展。中藥活性成分的代謝研究對中藥作用機理探討、

4、中藥新劑型研發(fā)、中藥質(zhì)量評價和中藥的臨床應(yīng)用等等,均具有指導(dǎo)意義和推動作用,已經(jīng)成為中藥現(xiàn)代化研究的重要切入點。 本論文分為5個部分,研究了中藥川芎揮發(fā)油的提取、主要有效成分的分離、有效成分的藥動學(xué)研究、組織間分布研究以及其體外代謝的影響因素研究和酶促反應(yīng)動力學(xué)研究。 第一部分 川芎揮發(fā)油的提取、物理參數(shù)測定及化學(xué)成分分析 目的：從川芎藥材中提取揮發(fā)油,并測定其物理參數(shù),分析其中的化學(xué)成分。 方法：用經(jīng)典

5、的水蒸汽蒸餾法從粉碎的川芎藥材中提取揮發(fā)油；采用比重瓶法測定其密度；應(yīng)用阿貝氏折光儀測定折光率；并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀研究其中的化學(xué)成分。 結(jié)果：水蒸汽蒸餾法提取川芎揮發(fā)油的產(chǎn)率為0.4％,測定川芎揮發(fā)油密度為0.9083g/mL,折光率為1.5331。GC-MS法測定得該揮發(fā)油中含有29種成分,其中以藁本內(nèi)酯含量最多,其次是正丁烯基苯酞、丁基苯酞、α-萜品醇。 第二部分 藁本內(nèi)酯單體的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒別 目的

6、：從川芎揮發(fā)油中分離純化藁本內(nèi)酯單體,鑒定其結(jié)構(gòu),并考察其穩(wěn)定性,以選擇合適的儲存條件。 方法：用玻璃柱層析法分離揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯單體,以硅膠為固定相,用石油醚(30～60℃)：乙酸乙酯(100:1)洗脫。運用薄層色譜法結(jié)合高效液相色譜法監(jiān)測流分,合并含單一成分的組分,并揮干溶劑后,得到的化合物進行紫外吸收光譜、紅外吸收光譜、核磁共振光譜和質(zhì)譜分析,鑒定其結(jié)構(gòu)。用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定該藁本內(nèi)酯的含量,并對其進行不同儲存條件

7、下的穩(wěn)定性考察。 結(jié)果：用硅膠柱層析法制備得到藁本內(nèi)酯單體,經(jīng)過四大光譜的結(jié)構(gòu)鑒別,確定為Z-藁本內(nèi)酯,純度為98.65％。并由4種儲存條件下藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示,溫度是影響藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性的主要因素,將藁本內(nèi)酯置于-20℃冷凍保存即能保持其基本穩(wěn)定,18個月的降解率為1.26％。 第三部分 口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯的代謝動力學(xué)研究 目的：建立生物樣品中藁本內(nèi)酯含量測定的高效液相色譜法,并將其應(yīng)用于藁本內(nèi)酯在

8、小鼠和大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。 方法：生物樣品用正己烷直接萃取濃縮后,注入高效液相色譜儀,以尼莫地平為內(nèi)標(biāo),選擇Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,預(yù)柱為Pelliguard TM LC-18,以乙腈-10％異丙醇水溶液(58:42)為流動相,流速為1.0 mL/min,在室溫下,于324 nm處進行分析測定,用內(nèi)標(biāo)法計算含量。數(shù)據(jù)用DAS軟件的雙峰模塊進行分析處理,并擬合藥動學(xué)參數(shù)。

9、結(jié)果：由藥時曲線可見,藁本內(nèi)酯進入體內(nèi)后吸收迅速,達峰時間短,且藥時曲線出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。DAS軟件擬合的結(jié)果顯示,藁本內(nèi)酯在大鼠體內(nèi)的t1/2為182 min,小鼠體內(nèi)為106 min。由此說明藁本內(nèi)酯在體內(nèi)的消除較快,滯留時間較短。 第四部分 口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯的組織分布特性研究 目的：建立適用于測定小鼠各組織中藁本內(nèi)酯的含量的HPLC法,并研究口服川芎揮發(fā)油后藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各組織間的分布特性。 方法：

10、生物樣品用正己烷直接萃取濃縮后,注入高效液相色譜儀,以尼莫地平為內(nèi)標(biāo),選擇Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,預(yù)柱為PelliguardTM LC-18,以乙腈-10％異丙醇水溶液為流動相,流速為1.0 mL/min,在室溫下,于324 nm處進行分析測定,用內(nèi)標(biāo)法計算含量。分別考察小鼠給以川芎揮發(fā)油后10 min、1 h、10 h時血漿及各組織中的藁本內(nèi)酯含量情況。 結(jié)果：藁本內(nèi)酯與內(nèi)標(biāo)物尼

11、莫地平保留時間分別為7.2 min和5.9 min,藁本內(nèi)酯在各組織中一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,各組織中低、中、高濃度的回收率及精密度均符合方法學(xué)要求。藁本內(nèi)酯在小鼠體內(nèi)各主要效應(yīng)器官之間分布特性是C肺>C心>C腦,在主要消除器官為C肝>C脾>C腎。在血漿和肝臟中藁本內(nèi)酯存在生物轉(zhuǎn)化。 第五部分 藁本內(nèi)酯在肝微粒體中體外代謝的初步研究 目的：建立測定肝微粒體孵育液中藁本內(nèi)酯含量的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,進行藁本內(nèi)酯體

12、外代謝影響因素的研究,并考察藁本內(nèi)酯的酶促反應(yīng)動力學(xué)。 方法：于肝微粒體溫孵液中加入等體積的冰冷的甲醇,以終止反應(yīng)同時沉淀其中的蛋白。取高速離心后的上清液適量,注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,以尼群地平為內(nèi)標(biāo),測定其中藁本內(nèi)酯的含量?？疾鞙胤鯐r間、酶蛋白濃度、底物濃度對藁本內(nèi)酯體外代謝的影響,并確定最佳溫孵條件,進行酶促反應(yīng)動力學(xué)研究,測定酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。通過六種同工酶的特異性抑制實驗,確定參與藁本內(nèi)酯代謝的主要同工酶。