部分遺傳性出血性疾病的基因診斷及分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、本研究對(duì)1例遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥家系和5例遺傳性血小板無(wú)力癥家系分別進(jìn)行了F7基因、αⅡb基因和β3基因的研究，并對(duì)所發(fā)現(xiàn)的F7基因的剪接位點(diǎn)突變IVS5-1 G>A進(jìn)行了異位轉(zhuǎn)錄和體外表達(dá)研究，以探討其導(dǎo)致遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的分子發(fā)病機(jī)制。 凝血因子Ⅶ（FⅦ）是主要由肝臟合成的依賴(lài)維生素K的凝血因子，它不僅是外源性凝血途徑的啟動(dòng)因子，在內(nèi)源性凝血途徑中也起著重要的作用。遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥是常染色體隱性遺傳性疾病，其發(fā)

2、病機(jī)制主要是由于F7基因異常，致使血漿中FⅦ功能發(fā)生障礙和（或）含量減少，從而發(fā)生出血癥狀。本研究對(duì)1例遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的家系進(jìn)行了表型診斷、家系調(diào)查、基因診斷和發(fā)病機(jī)制的研究。此家系先證者有反復(fù)血尿、牙齦出血和口腔粘膜出血癥狀；表型檢測(cè)顯示其APTT正常，PT延長(zhǎng)，F(xiàn)Ⅶ:C和FⅦ:Ag都降低（分別為4.4％和38.5％）；F7基因分析顯示其帶有2種不同形式的雜合突變，即錯(cuò)義突變10902T>G導(dǎo)致Cys329Gly以及剪接位點(diǎn)突

3、變IVS5-1G>A。家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其父母為F7基因缺陷的雜合子，臨床無(wú)出血表現(xiàn)；先證者胞姐帶有與先證者同樣的復(fù)合雜合突變，有月經(jīng)過(guò)多及皮膚粘膜出血癥狀。 IVS5-1G>A是國(guó)際首次報(bào)道的F7基因突變。為研究其對(duì)FⅦ mRNA剪接的影響，本研究利用逆轉(zhuǎn)錄結(jié)合巢式PCR的方法分析患者外周血白細(xì)胞的FⅦ異位轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果只檢測(cè)到正常轉(zhuǎn)錄本。此后，進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄研究，PCR擴(kuò)增F7基因第4到第7號(hào)內(nèi)含子片段，構(gòu)建第5號(hào)內(nèi)含子-1位含A

4、的突變型質(zhì)粒和含G的野生型質(zhì)粒，將2種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，抽提RNA，RT-PCR后克隆入pcDNA3.1(-)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果在轉(zhuǎn)染了野生型質(zhì)粒的細(xì)胞總RNA中F7基因的5、6、7號(hào)外顯子能正常剪接，而轉(zhuǎn)染了突變型質(zhì)粒的細(xì)胞總RNA中發(fā)生了F7基因6號(hào)外顯子缺失。F7基因的6號(hào)外顯子缺失，導(dǎo)致讀碼框移位，在FⅦ Thr130后編碼了53個(gè)不同的氨基酸后提前產(chǎn)生終止密碼。提前產(chǎn)生的終止密碼在體內(nèi)通常會(huì)通過(guò)無(wú)義突變介導(dǎo)的mRNA

5、降解機(jī)制介導(dǎo)相應(yīng)mRNA的降解。因此，缺失了6號(hào)外顯子的FⅦ異常轉(zhuǎn)錄本，由于帶有提前終止密碼子而使其在體內(nèi)快速降解，從而不會(huì)有翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生，導(dǎo)致了遺傳性凝血因子Ⅶ缺陷癥的發(fā)生。 遺傳性血小板無(wú)力癥是一種少見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的血小板功能缺陷性疾病，其特點(diǎn)是由于血小板膜αⅡb或（和）β3的數(shù)量或（和）質(zhì)量異常而引起血小板對(duì)多種生理激動(dòng)劑的誘聚反應(yīng)缺乏或明顯降低，患者常終身存在出血傾向，主要表現(xiàn)為皮膚粘膜出血。本病可分為I、II、

6、III三型：I型占大多數(shù)(78％)，血小板表面αIIbβ3<正常的5％；II型占14％，血小板表面αIIbβ3為正常的10％～20％；III型，又稱(chēng)變異型，占8％，血小板表面αIIbβ3為正常的50％～100％。I型和II型血小板無(wú)力癥是由血小板表面αIIbβ3數(shù)量的減少所致，而變異型血小板無(wú)力癥是由血小板表面αIIbβ3質(zhì)的異常所致。?、騜β3復(fù)合物是由一雙鏈的αⅡb亞基與一單鏈的β3亞基經(jīng)非共價(jià)鍵結(jié)合而成的異源二聚體，為血小板膜上最

7、多的一種糖蛋白，屬于整合素家族，是纖維蛋白原和多種黏附蛋白的受體，在加速血小板血栓形成中起著重要作用。?、騜和β3分別由單獨(dú)的基因編碼，大部分αⅡb或（和）β3基因的異常會(huì)導(dǎo)致αⅡbβ3復(fù)合物的膜表達(dá)量缺乏或減少，有少數(shù)基因異常只引起αⅡbβ3復(fù)合物功能下降而表達(dá)量基本正常。 本研究對(duì)5例遺傳性血小板無(wú)力癥家系進(jìn)行了表型診斷、家系調(diào)查和基因診斷研究。通過(guò)血小板聚集試驗(yàn)及全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)明確臨床診斷；PCR擴(kuò)增先證者αⅡb及β

8、3基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，用末端標(biāo)記雙脫氧法測(cè)序。含雜合缺失突變的外顯子通過(guò)構(gòu)建TA克隆及測(cè)序以證實(shí)。新的基因改變?cè)?00例正常人相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行基因多態(tài)性的篩查。家系成員DNA則僅在先證者αⅡb基因或β3基因突變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。研究顯示，5例家系的先證者均表現(xiàn)為出血時(shí)間延長(zhǎng)；全血涂片上血小板散在不聚集；二磷酸腺苷、腎上腺素、膠原、花生四烯酸等多種誘聚劑誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)均低下，而瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)基本正常；流式檢測(cè)

9、顯示家系1、家系2、家系4和家系5先證者的血小板膜表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)表達(dá)基本缺失，診斷為Ⅰ型血小板無(wú)力癥；家系3先證者血小板膜表面CD41(αⅡb)和CD61(β3)陽(yáng)性的血小板百分率分別為88.5％和99.5％，診斷為Ⅲ型血小板無(wú)力癥。對(duì)先證者及其家系成員的基因分析顯示，家系1、2、3和5的先證者αⅡb基因中均帶有復(fù)合雜合突變，分別為1750C>T（Arg553Stop）和2671C>T（Glu48Stop）、2

10、35G>T（Glu48Stop）和2671C>T、1084T>C（Phe331Leu）和1772A>C（Asp560Ala）、2333A>C（Gln747Pro）和3060G>C（Lys989Asn或剪接異常）；家系4先證者αⅡb基因的1號(hào)外顯子存在純合缺失突變69-79del，導(dǎo)致移碼突變，終止密碼提前。通過(guò)5個(gè)GT家系的基因診斷研究，共發(fā)現(xiàn)了8種發(fā)生于αⅡb基因的突變，其中235G>T（Glu48Stop）、1084T>C（Phe3