遺傳性出血性疾病的臨床和發(fā)病機理研究.pdf

1、本文利用在血栓與止血領(lǐng)域的優(yōu)勢，深入開展遺傳性出血性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，闡明其發(fā)病的分子機制，解決這類特殊患者的痛苦，并提高我院血栓與止血的研究水平。 目的：分別對1例遺傳性無纖維蛋白原血癥(hereditaryafibrinogenemia，HAF)和遺傳性凝血因子XlII缺乏癥(hereditaryfactorXlIIdeficiency，HFXIIID)進行基因分析和家系調(diào)查，闡明HAF和HFXIIID發(fā)病的分子機制；研

2、究一種具有異常超微結(jié)構(gòu)的遺傳性巨血小板減少癥(hereditarymacrothrombocytopenia，HMTC)的形態(tài)與功能。 方法：1．凝血酶法與免疫比濁法測定纖維蛋白原(Fg)，提取HAF家系先證者及其家系成員外周血基因組DNA，PCR法擴增其Fg的FGA、FGB和FGG基因所有外顯子和側(cè)翼序列，DNA序列分析確定Fg的基因異常。將先證者突變序列、家系成員和50名正常人相應(yīng)序列的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶RsaI消化，

3、以進一步確定基因突變并排除基因多態(tài)性。2．分別用尿素溶解法和試劑盒法檢測HFXIIID患者及其家系成員血漿FXIII的活性，并用火箭電泳法和酶聯(lián)免疫吸附實驗測定其FXIII抗原含量。PCR法擴增F／3A基因的所有外顯子和側(cè)翼序列，DNA測序分析基因異常，用直接測序法和限制性內(nèi)切酶(SfanI、NspI)分析80名正常人相應(yīng)序列的PCR產(chǎn)物以排除基因多態(tài)性。應(yīng)用生物信息學軟件對所發(fā)現(xiàn)的突變進行分子模建，探討其致病的分子機制。3．采集HMT

4、C患者外周靜脈血，分離富血小板血漿，用流式細胞術(shù)結(jié)合多種抗血小板膜糖蛋白(GP)單克隆抗體，測定血小板膜GPIb、GPIIb、GPIIIa、P選擇素和CD63的表達；以常規(guī)超薄切片術(shù)、免疫電鏡技術(shù)檢測患者血小板及其異常超微結(jié)構(gòu)的性質(zhì)：用熒光分光光度法測定血小板5．羥色胺含量。 結(jié)果：1．HAF先證者及其父親的血漿Fg用Clauss法檢測不到，免疫比濁法測定時，F(xiàn)g含量均<0．02g／L，兩者FGA基因外顯子4第3108位核苷酸發(fā)

5、生C—T純合性改變，使Fg的Aa鏈第150位密碼子(CAG，編碼Gin)突變?yōu)榻K止密碼TAG，即Q150X。先證者及其父親FGA基因外顯子4和側(cè)翼序列的PCR產(chǎn)物不能被RsaI酶切，而正常人和該家系中的部分成員可被完全酶切，先證者母親和家系中其他6個成員的PCR產(chǎn)物被部分酶切。’2．HFXIIID患者纖維蛋白凝塊在5M尿素中30min內(nèi)完全溶解，加入正常人血漿后則24h不溶解，患者血漿FXIII活性為0，F(xiàn)XIIIA抗原含量＜2％，F(xiàn)X

6、IIIB抗原含量在正常范圍。家系成員中其父母和外婆血漿FXIII活性和FXIIIA抗原約為正常人一半。在患者F13A基因外顯子15中發(fā)現(xiàn)兩處雜合異常，分別位于177246位堿基(C—T，導(dǎo)致Arg703一Zrp即R703W)和177286位堿基(A—G，導(dǎo)致His716一Atg即H716R)，直接測序和酶切兩種方法均排除了基因多態(tài)性?；颊叩哪赣H與外婆為Arg703一Trp雜合子，患者的父親為His716一Arg雜合子。分子模建分析表明，

7、Arg703和His716兩個位點突變后可導(dǎo)致FXIIIA蛋白barrel2與core結(jié)構(gòu)域之間距離和結(jié)合能力的改變，使得蛋白質(zhì)發(fā)生錯誤折疊，穩(wěn)定性降低。His716一Arg還可能影響了酶的催化活性的空間結(jié)構(gòu)形成。3．HMTC患者及其父親血小板表面GPIb、GPIIb和GPIIIa的表達正常，陽性細胞百分數(shù)及平均熒光強度與正常對照基本相同，但P選擇素和CD63的表達較高；兩者血小板內(nèi)均有數(shù)量不等的高電子密度大顆粒，有膜包裹，且有胞吐現(xiàn)象

8、；用免疫電鏡技術(shù)證實該顆粒P選擇素、CD63反應(yīng)均陰性，可排除超大顆粒為異常的Q顆?；蛉苊阁w的可能性；患者及其父親血小板5．羥色胺含量正常，證明超大顆粒不是異常的致密顆粒。 結(jié)論：LFGA基因外顯子4Q150X無義突變是導(dǎo)致所發(fā)現(xiàn)的HAF家系中患者發(fā)病的原因。該家系先證者及其父親均表現(xiàn)出典型HAF的特征，此外尚有部分成員為攜帶者。FGA基因Q150X突變是一種國際上尚未報道的導(dǎo)致HAF的新的突變類型。2．HFXIIID患者F13