Daintain-AIF-1在Ⅰ型糖尿病發(fā)生中的作用.pdf

1、1型糖尿病是一種T細(xì)胞介導(dǎo)、以胰腺beta細(xì)胞特異性損傷為特征的自身性免疫疾病，目前臨床上主要靠終身注射胰島素維持患者生命。1型糖尿病的早期病理特征是胰島炎，主要表現(xiàn)為活化的單核免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞等）浸潤(rùn)胰島，這些細(xì)胞釋放的介質(zhì)（細(xì)胞因子、一氧化氮和氧自由基等），直接損傷胰腺beta細(xì)胞。雖然1型糖尿病發(fā)病的分子機(jī)理還不清楚，但積累的證據(jù)顯示與機(jī)體免疫相關(guān)的細(xì)胞因子在這一過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 上世紀(jì)9

2、0年代，Dr Chen從豬小腸中分離并鑒定出一個(gè)多肽，命名為daintain。與此同時(shí)，Utans等從鼠心臟移植排斥物中克隆出一個(gè)巨噬細(xì)胞因子－異體移植炎癥因子1（allograft inflammatory factor-1，AIF-1），兩者氨基酸序列高度同源，故稱daintain/AIF-1。作為一個(gè)與炎癥相關(guān)的巨噬細(xì)胞因子，daintain/AIF-1引起了許多學(xué)者的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室前期研究顯示在發(fā)生胰腺炎的1型糖尿病模型鼠胰腺中

3、存在大量的daintain/AIF-1，而正常鼠胰腺中很少，提示了daintain/AIF-1參與了1型糖尿病的發(fā)生，為了進(jìn)一步探討daintain/AIF-1在1型糖尿病發(fā)生中的作用及機(jī)理，本論文主要開(kāi)展了以下工作：
　　 1.分離純化daintain/AIF-1 以豬小腸為原料，通過(guò)Sephadex G-25（fine）凝膠過(guò)濾和DEAE纖維素弱陰離子交換層析以及兩次高效液相色譜等方法分離蛋白組分，純化出了daintain/

4、AIF-1。
　　 2.制備daintain/AIF-1和胰島素的單克隆抗體。以純化的daintain/AIF-1和購(gòu)買(mǎi)的胰島素為免疫原免疫Balb/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)，采用間接酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的方法篩選分別針對(duì)daintain/AIF-1和胰島素的單克隆細(xì)胞株，并鑒定了抗體的效價(jià)、亞類以及親和常數(shù)。
　　 3.研究daintain/AIF

5、-1在1型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中的可能作用。利用制備的daintain/AIF-1及其單克隆抗體，通過(guò)免疫共沉淀和western blotting，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中存在daintain/AIF-1，證明daintain/AIF-1是一個(gè)分泌的胞外蛋白。間接ELISA顯示 1型糖尿病模型NOD（non obese diabetic）小鼠血清中daintain/AIF-1的含量顯著高于同周齡的Balb/c小鼠。用組織免疫化學(xué)法，發(fā)現(xiàn)daintai

6、n/AIF-1在發(fā)生1型糖尿病模型BB（biobreeding）大鼠的胰腺中密集，且胰腺beta細(xì)胞逐漸消失，說(shuō)明daintain/AIF-1參與了損害beta細(xì)胞的作用，從而在1型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起一定作用。
　　 4.進(jìn)而在細(xì)胞以及機(jī)體水平上研究了daintain/AIF-1促進(jìn)并導(dǎo)致1型糖尿病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)理。給NOD鼠靜脈注射daintain/AIF-1后，其白細(xì)胞升高，血中胰島素減少，伴隨血糖升高，導(dǎo)致NOD鼠提前

7、發(fā)生糖尿病。免疫組化結(jié)果顯示其胰腺中胰島萎縮，beta細(xì)胞量很少。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)觀察到daintain/AIF-1可抑制胰島素分泌，直接破壞胰島細(xì)胞。將daintain/AIF-1標(biāo)記上異硫氰酸熒光素（fluorescinisothiocyate，F(xiàn)ITC），利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡和流式細(xì)胞技術(shù)，檢測(cè)胰島細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，顯示daintain/AIF-1可與胰島細(xì)胞結(jié)合。利用親和層析，尋找并提取daintain/AIF-1在胰腺中的相互作

8、用蛋白，經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶切，肽指紋圖譜測(cè)定，以及肽段測(cè)序，鑒定出一個(gè)相互作用蛋白為胱硫醚beta合成酶。
　　 5.Daintain/AIF-1對(duì)血液生物學(xué)特性的影響。將外源daintain/AIF-1靜脈注射入昆明鼠可引發(fā)炎癥反應(yīng)，例如激發(fā)氧化物產(chǎn)生，降低超氧化物岐化酶的活性，引起游離血紅素釋放，增高血漿c反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原的含量，伴隨著血液粘度的提高，造成血液在空氣中更快速的凝固，提高在體內(nèi)促進(jìn)血液凝固的功能。Daintain/

9、AIF-1處理后的小鼠血清可以消耗更多的還原劑二巰基蘇糖醇。鎳-組氨酸pull down以及western blotting鑒定daintain/AIF-1在血液中與血紅蛋白beta亞基1結(jié)合，促進(jìn)紅細(xì)胞裂解，血紅素釋放。炎癥、氧化應(yīng)激以及游離的血紅素作為糖尿病血管并發(fā)癥主要誘因的事實(shí)提示daintain/AIF-1與糖尿病的血管并發(fā)癥相關(guān)。
　　 以上研究表明daintain/AIF-1是1型糖尿病的致病因子之一，參與并促進(jìn)了