炎癥因子Daintain-AIF-1對胰腺β細胞功能影響的研究.pdf

1、Daintain（大炎肽）是1994年由Chen等從豬的小腸中分離純化出的一種新的生物活性蛋白，其氨基酸序列與1995年由Utans等人在大鼠心臟移植排斥反應中克隆出的巨噬細胞因子Allograft Inflammatory Factor-1（同種異體移植炎癥因子-1，AIF-1）高度同源（90％），兩者屬不同物種來源的同一蛋白質，故并稱為Daintain/AIF-1。Daintain/AIF-1分子量17kD，主要由激活的巨噬細胞表達

2、和分泌，是一種多功能的細胞因子，廣泛參與炎癥和免疫相關的多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如血管病變、移植排斥、腫瘤以及自身免疫疾病等。
　　1型糖尿病(Type1 Diabetes Mellitum,T1DM)是一種T淋巴細胞介導的自身免疫疾病，以胰島炎引發(fā)的胰島β細胞的選擇性破壞為特征。在發(fā)病前的胰島炎階段，活化的巨噬細胞、T淋巴細胞等大量浸潤胰島，釋放出炎癥介質如細胞因子和NO等協(xié)同作用，引起β細胞凋亡、壞死以及胰島素分泌異常等功能損

3、傷，進而發(fā)展為T1DM。目前T1DM發(fā)病的分子機理還未完全闡明，但大量研究表明炎癥和免疫相關的細胞因子在這一進程中起著關鍵作用。我們的前期研究發(fā)現Daintain/AIF-1在正常胰腺組織中不表達，但在T1DM模型BB大鼠侵潤胰腺的巨噬細胞中大量表達，表明炎癥因子Daintain/AIF-1與T1DM的發(fā)病機理有關，但具體機制仍未明確。為了研究Daintain/AIF-1在T1DM發(fā)病中的作用，本論文主要開展了以下工作：
　　第一

4、部分：以大鼠β細胞系INS-1為實驗模型，在細胞水平上研究了Daintain/AIF-1對T1DM中β細胞功能異常的影響。在細胞培養(yǎng)基中添加不同濃度的Daintain/AIF-1刺激后，檢測INS-1細胞活力、凋亡、周期、胰島素分泌和NO產量的變化，結果發(fā)現：
　　1. Daintain/AIF-1對INS-1細胞具有毒性作用，能抑制細胞活力。
　　2. Daintain/AIF-1能夠誘導INS-1細胞的凋亡，特別是早期凋

5、亡。提示Daintain/AIF-1可能在凋亡的起始階段起刺激性作用，最終導致INS-1細胞活力的降低。
　　3. Daintain/AIF-1不影響INS-1細胞的基礎胰島素分泌，但是抑制了20mM葡萄糖條件下的葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）水平，說明Daintain/AIF-1損傷了INS-1細胞的葡萄糖反應性，這是Daintain/AIF-1對INS-1細胞毒性作用的另一個方面。
　　4. Daintain/AIF

6、-1顯著提升了INS-1細胞的NO產量，推測NO水平的上升可能和細胞凋亡的增加和GSIS的下降有關，可能是Daintain/AIF-1誘導的β細胞毒性作用的機制之一。
　　5. Daintain/AIF-1影響INS-1細胞周期，將細胞阻滯在G0/G1期，使得進入S期和G2/M期的細胞減少，以此來抑制細胞增殖，且Daintain/AIF-1濃度越大，作用越明顯。
　　第二部分：尋找Daintain/AIF-1在胰腺中的相互作

7、用蛋白，為深入了解Daintain/AIF-1對β細胞毒性作用機制提供思路。采用Clontech MatchmakerTM GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)3來進行人胰腺MatchmakerTM cDNA文庫中Daintain/AIF-1相互作用蛋白基因的篩選，主要結果為：
　　1.構建了誘餌質粒pGBKT7-Daintain/AIF-1，經檢測可以在AH109酵母中正
　　確表達出誘餌融合蛋白BD-Daintain/AIF-1，對酵

8、母細胞無毒性，且沒有自激活性。
　　2.擴增了人胰腺cDNA文庫，轉化入AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1酵母，涂布SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板并進行β-半乳糖苷酶活性檢測，初步篩選出64個Ade+His+lacZ+三陽性候選酵母克隆。
　　3.進行回轉實驗和一對一驗證實驗排除假陽性，結果僅獲得1種文庫質粒。對其cDNA插入片段測序后Blast比對并進行閱讀框分析，發(fā)現該片段翻譯時發(fā)生

9、了移碼，僅表達出一段32個氨基酸殘基的未知小肽段，說明該質粒是假陽性。本次篩選未獲得陽性結果，是酵母雙雜交系統(tǒng)假陽性率非常高這一重大缺陷的一次實例。
　　綜上，本研究首次發(fā)現Daintain/AIF-1對INS-1細胞具有毒性作用，Daintain/AIF-1可能通過將細胞阻滯在G0/G1期來抑制細胞增殖，以及上調NO產量來刺激細胞凋亡和損傷胰島素分泌。這說明細胞因子Daintain/AIF-1促進了β細胞的功能異常，在T1DM的